Activación de células nk alogénicas como herramienta de inmunoterapia frente a cánceres hematológicos
- Autores: Juan Diego Sánchez Martínez
- Directores de la Tesis: Julián Pardo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: L. Anel (presid.), Martín Villalba González (secret.), Miguel López Botet (voc.)
- Materias:
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- Resumen
INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES Durante los últimos años, dentro de la búsqueda de nuevas alternativas para el tratamiento del cáncer, la inmunoterapia ha ido aumentando su relevancia. La posibilidad de emplear el sistema inmune o alguno de sus componentes en solitario o en combinación con tratamientos clásicos, se encuentra ahora en su momento de mayor repercusión (Couzin-Frankel, 2013), y todo hace indicar que será mayor en un futuro próximo.
Entender los mecanismos por los que las células citotóxicas son capaces de reconocer y eliminar a los tumores, y la manera de potenciarlos resulta fundamental en el objetivo de encontrar nuevas posibilidades terapéuticas. Nuestro grupo, con experiencia en el modelo humano y de ratón ha contribuido a describir estos procesos (Aguilo et al., 2010; Pardo et al., 2009; Pardo et al., 2002). Del mismo modo, el conocimiento de las transformaciones que realizan las células tumorales para alcanzar resistencia a los tratamientos ha centrado nuestra atención (Balsas et al., 2012; Galan-Malo et al., 2012; Marzo and Naval, 2008). De hecho, nuestro grupo posee una extensa colección de líneas celulares procedentes de cánceres hematológicos, que presentan sobreexpresión o silenciamiento de proteínas claves en la muerte celular. Esto les confiere resistencia al tratamiento con drogas clásicas de quimioterapia (Galan-Malo, 2010).
Las células citotóxicas, CTLs y células NK, expresan una serie de proteínas que presentan capacidad para eliminar células dañadas por infección o transformación. De hecho, esas proteínas tienen potencial para superar determinados bloqueos de resistencia a la muerte presentados por algunas células tumorales (Pardo et al., 2008), que las hacen resistentes a los estímulos clásicos.
Los métodos para emplear a las células NK de manera directa, o dentro de un trasplante de médula, están aumentando, y existen numerosos ensayos clínicos en los que se emplean este tipo de células. En concreto, las células NK alogénicas, es decir, células procedentes de un donante que se introducen en otro individuo como receptor, que es el paciente que padece el tumor, tienen especial relevancia. En los tumores hematológicos es una práctica común la del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas, donde son las células NK y las células T las responsables del efecto GvL, careciendo las células NK del efecto GvHD.
Se ha descrito la efectividad de las células NK alogénicas frente a determinados tumores hematológicos como MM, LLA y LMA de mal pronóstico o en recaída (Fuchs et al., 2010; Locatelli et al., 2013; Rubnitz et al., 2010; Ruggeri et al., 2007; Shi et al., 2008; Szmania et al., 2015; Tavernier et al., 2007; Velardi, 2012; Willemze et al., 2009). Sin embargo, se carece de una explicación a nivel molecular del mecanismo, y de los elementos empleados por parte de las células NK, para eliminar a las células tumorales que presentan resistencia a los tratamientos clásicos.
Con el objeto de evitar la recaída de un tumor, la combinación de diferentes fármacos o incluso técnicas distintas se ha convertido en una realidad actualmente. De hecho nuestro punto de partida no es el de una alternativa que sustituya a los fármacos empleados en clínica, sino que planteamos la búsqueda de otras opciones cuando los anteriores fallan. De la misma forma la inclusión de estas técnicas en combinación con otros tratamientos ya establecidos puede ser una posibilidad.
Por todo lo anterior, a la hora de realizar esta tesis doctoral, nos planteamos una serie de objetivos, que se expondrán a continuación. Con ellos quisimos continuar en la línea de los últimos avances en el laboratorio, tratando a la vez de iniciar un nuevo camino en el modelo humano in vitro empleando las células NK como pieza fundamental.
En este trabajo la hipótesis de partida se centra en el potencial de las células del sistema inmune de eliminar células tumorales incluso cuando éstas son resistentes a la muerte celular. Los distintos mecanismos efectores podrían superar las barreras de bloqueo de la muerte celular que presentan determinadas células tumorales debido a mutaciones específicas. Por tanto, si fueran capaces de reconocer a la célula diana, las células NK en nuestro caso, serían capaces de matar incluso a aquellas que presentan resistencia a otros tratamientos.
OBJETIVOS Y DESARROLLO El objetivo general de esta tesis ha sido desarrollar y caracterizar en detalle un modelo de activación de células NK alogénicas, evaluando su capacidad para eliminar neoplasias hematológicas resistentes a quimioterapia debido a mutaciones en la maquinaria de apoptosis.
Para ello, se han planteado diferentes objetivos intermedios:
1) Optimizar el mejor protocolo de activación de células NK alogénicas in vitro Partiendo de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, del inglés peripheral blood mononuclear cells) tratamos de encontrar una activación eficiente de las células NK, que fuera capaz de aumentar la capacidad citotóxica que presentan estas células aisladas ex vivo. Para ello, estudiamos los distintos cambios sufridos por las células NK durante la etapa de activación con diferentes estímulos. Empleamos un ¿array¿ de mRNA y otro de miRNA para conocer los cambios transcripcionales, en paralelo con ensayos de citotoxicidad, evaluando la capacidad de las células NK para eliminar a distintas células diana. De la misma forma, resulta fundamental analizar la capacidad proliferativa de las células NK para tratar de encontrar las condiciones óptimas de estimulación.
2) Caracterización del modelo de activación con células linfoblastoides EBV+ Hemos descrito en profundidad los cambios que se producen en las células NK durante la activación con células EBV+ linfoblastoides, en presencia del resto de PBMCs y en ausencia de citoquinas. La determinación del mecanismo efector empleado por las células NK resulta clave. Del mismo modo, el análisis de las subpoblaciones de células NK presentes, su nivel de expresión de proteínas citotóxicas y de receptores expresados en su superficie centran la caracterización de las células efectoras generadas en nuestro sistema.
3) Evaluar la capacidad de las células NK alogénicas para eliminar líneas celulares tumorales de origen hematológico resistentes a drogas de quimioterapia Basándonos en la literatura y en el trabajo previo en nuestro grupo, tratamos de conocer si células NK que presentan una aumentada capacidad citotóxica, podían eliminar a células resistentes a quimioterapia. Para ello, empleamos la colección de líneas celulares presentes en nuestro grupo procedentes de distintos tumores hematológicos. Además, conocer si la muerte celular era apoptosis, y si se producía incluso cuando ésta está inhibida, era clave para saber el potencial en el empleo de células NK alogénicas como alternativa terapéutica. Para esto, determinar el nivel de muerte inducido en ensayos de citotoxicidad, atendiendo al mecanismo (Caspasa-3), y analizar el nivel de inhibición de la muerte si la hubiera supuso el principio a desarrollar en este apartado.
4) Estudiar el potencial de las células NK alogénicas para eliminar células de pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) La LLC presenta una especial relevancia ya que es la más común de las leucemias en adultos en el mundo occidental (Zenz et al., 2010). Por esta razón, decidimos analizar si las células NK alogénicas son capaces de eliminarlas, y bajo qué condiciones. Comprobar si las LLC resistentes a quimioterapia son igualmente sensibles a la acción de estas células NK resulta clave en nuestro planteamiento de poseer una herramienta frente a tumores refractarios. Finalmente analizar la seguridad de este posible tratamiento utilizando PBMCs de donantes sanos fue otro de los objetivos en este CONCLUSIONES Los mecanismos por los que las células del sistema inmune, y en particular las células NK, realizan su acción frente a tumores e infecciones son complejos, y están supeditados a multitud de factores. En este trabajo nos hemos centrado en la capacidad de las células NK aquellas que son resistentes a los tratamientos de quimioterapia. Para ello, hemos tratado de encontrar un modelo de activación óptimo, lo hemos caracterizado, y lo hemos analizado en modelos celulares de resistencia a fármacos y en muestras de pacientes de LLC.
A lo largo de esta tesis se han alcanzado las siguientes conclusiones:
1.- El estímulo empleado es clave en la activación de las células NK, mucho más que el donante empleado.
2.- La utilización de células estimuladoras, empleando el conjunto de PBMCs, produjo una mayor activación de las células NK que las citoquinas exógenas.
3.- El empleo de ATRA (inductor del miR23a), disminuye la actividad de la CTSC y de la gzmB in vitro, teniendo como consecuencia una disminución en la capacidad citotóxica de las células NK.
4.- La administración in vivo de ATRA en ratones produce una reducción en la actividad de la gzmB en las células NK.
5.- Las células linfoblastoides EBV+ en ausencia de citoquinas consiguen una mayor activación y proliferación que las células K562 en presencia de IL-2 y/o IL-15 sobre las células NK.
6.- Las células NK generadas por activación con células R69 inducen apoptosis sobre líneas celulares de cáncer hematológico por el mecanismo de exocitosis granular.
7.- Distintas subpoblaciones linfocitarias colaboran en la activación de las células NK en presencia de las células R69.
8.- El aumento en la capacidad citotóxica de las células NK activadas con células R69 correlaciona con un aumento en la cantidad de gzmB, y en el porcentaje de expresión de los receptores DNAM-1, NKp30, NKp44 y NKG2A, y con la bajada de ILT2.
9.- Las células NK alogénicas activadas con células R69 son capaces de eliminar a mutantes de la línea celular Jurkat con inhibición de la vía mitocondrial de apoptosis, incluso cuando se encuentra inhibida la caspasa-3.
10.- Las células NK alogénicas activadas con células R69 activan a la caspasa-3 cuando la vía mitocondrial está inhibida por la sobreexpresión de Bcl-XL.
11.- Las células NK alogénicas activadas con células R69 son capaces de eliminar otros tipos de tumores hematológicos, líneas celulares U937 y MM.1S, incluso a mutantes que presentan resistencia a los tratamientos de quimioterapia.
12.- Las células NK alogénicas activadas con células R69 son capaces de eliminar a las células de LLC si bien existe una gran variabilidad entre los distintos pacientes. Ésta variabilidad no depende de la susceptibilidad de los pacientes a los tratamientos utilizados previamente.
13.- La expresión de MHC-I por parte de las células estimuladoras B linfoblastoides no modifica la capacidad de las células NK alogenicas activadas para eliminar a las células de LLC.
14.- La expresión de ligandos para los receptores NKp30, NKp46 y NKG2D, así como la expresión de HLA-ABC, HLA-E, ICAM-1, DR4 y DR5 no se correlaciona con la variabilidad mostrada por parte de las células de LLC a las células NK alogénicas activadas con células R69.
15.- El grado de histocompatibilidad no es el responsable único de la variabilidad mostrada por parte de las células de LLC a las células NK alogénicas activadas con células R69.
BIBLIOGRAFÍA Aguilo, J.I., A. Anel, E. Catalan, A. Sebastian, R. Acin-Perez, J. Naval, R. Wallich, M.M. Simon, and J. Pardo. 2010. Granzyme B of cytotoxic T cells induces extramitochondrial reactive oxygen species production via caspase-dependent NADPH oxidase activation. Immunology and cell biology. 88:545-554.
Balsas, P., P. Galan-Malo, I. Marzo, and J. Naval. 2012. Bortezomib resistance in a myeloma cell line is associated to PSMbeta5 overexpression and polyploidy. Leukemia research. 36:212-218.
Couzin-Frankel, J. 2013. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342:1432-1433.
Fuchs, E.J., X.J. Huang, and J.S. Miller. 2010. HLA-haploidentical stem cell transplantation for hematologic malignancies. Biology of blood and marrow transplantation : journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation. 16:S57-63.
Galan-Malo, P. 2010. Papel de las proteínas de la familia Bcl-2 en la apoptosis inducida por fármacos antitumorales. Tesis Doctoral. Universidad de Zaragoza.
Galan-Malo, P., L. Vela, O. Gonzalo, R. Calvo-Sanjuan, L. Gracia-Fleta, J. Naval, and I. Marzo. 2012. Cell fate after mitotic arrest in different tumor cells is determined by the balance between slippage and apoptotic threshold. Toxicology and applied pharmacology. 258:384-393.
Locatelli, F., D. Pende, M.C. Mingari, A. Bertaina, M. Falco, A. Moretta, and L. Moretta. 2013. Cellular and molecular basis of haploidentical hematopoietic stem cell transplantation in the successful treatment of high-risk leukemias: role of alloreactive NK cells. Frontiers in immunology. 4:15.
Marzo, I., and J. Naval. 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy. Biochemical pharmacology. 76:939-946.
Pardo, J., J.I. Aguilo, A. Anel, P. Martin, L. Joeckel, C. Borner, R. Wallich, A. Mullbacher, C.J. Froelich, and M.M. Simon. 2009. The biology of cytotoxic cell granule exocytosis pathway: granzymes have evolved to induce cell death and inflammation. Microbes and infection / Institut Pasteur. 11:452-459.
Pardo, J., S. Balkow, A. Anel, and M.M. Simon. 2002. The differential contribution of granzyme A and granzyme B in cytotoxic T lymphocyte-mediated apoptosis is determined by the quality of target cells. European journal of immunology. 32:1980-1985.
Pardo, J., R. Wallich, P. Martin, C. Urban, A. Rongvaux, R.A. Flavell, A. Mullbacher, C. Borner, and M.M. Simon. 2008. Granzyme B-induced cell death exerted by ex vivo CTL: discriminating requirements for cell death and some of its signs. Cell death and differentiation. 15:567-579.
Rubnitz, J.E., H. Inaba, R.C. Ribeiro, S. Pounds, B. Rooney, T. Bell, C.H. Pui, and W. Leung. 2010. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 28:955-959.
Ruggeri, L., A. Mancusi, M. Capanni, E. Urbani, A. Carotti, T. Aloisi, M. Stern, D. Pende, K. Perruccio, E. Burchielli, F. Topini, E. Bianchi, F. Aversa, M.F. Martelli, and A. Velardi. 2007. Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia: challenging its predictive value. Blood. 110:433-440.
Shi, J., G. Tricot, S. Szmania, N. Rosen, T.K. Garg, P.A. Malaviarachchi, A. Moreno, B. Dupont, K.C. Hsu, L.A. Baxter-Lowe, M. Cottler-Fox, J.D. Shaughnessy, Jr., B. Barlogie, and F. van Rhee. 2008. Infusion of haplo-identical killer immunoglobulin-like receptor ligand mismatched NK cells for relapsed myeloma in the setting of autologous stem cell transplantation. British journal of haematology. 143:641-653.
Szmania, S., N. Lapteva, T. Garg, A. Greenway, J. Lingo, B. Nair, K. Stone, E. Woods, J. Khan, J. Stivers, S. Panozzo, D. Campana, W.T. Bellamy, M. Robbins, J. Epstein, S. Yaccoby, S. Waheed, A. Gee, M. Cottler-Fox, C. Rooney, B. Barlogie, and F. van Rhee. 2015. Ex vivo-expanded natural killer cells demonstrate robust proliferation in vivo in high-risk relapsed multiple myeloma patients. Journal of immunotherapy. 38:24-36.
Tavernier, E., J.M. Boiron, F. Huguet, K. Bradstock, N. Vey, T. Kovacsovics, A. Delannoy, N. Fegueux, P. Fenaux, A. Stamatoullas, O. Tournilhac, A. Buzyn, O. Reman, C. Charrin, C. Boucheix, J. Gabert, V. Lheritier, J.P. Vernant, H. Dombret, and X. Thomas. 2007. Outcome of treatment after first relapse in adults with acute lymphoblastic leukemia initially treated by the LALA-94 trial. Leukemia. 21:1907-1914.
Velardi, A. 2012. Natural killer cell alloreactivity 10 years later. Current opinion in hematology. 19:421-426.
Willemze, R., C.A. Rodrigues, M. Labopin, G. Sanz, G. Michel, G. Socie, B. Rio, A. Sirvent, M. Renaud, L. Madero, M. Mohty, C. Ferra, F. Garnier, P. Loiseau, J. Garcia, L. Lecchi, G. Kogler, Y. Beguin, C. Navarrete, T. Devos, I. Ionescu, K. Boudjedir, A.L. Herr, E. Gluckman, and V. Rocha. 2009. KIR-ligand incompatibility in the graft-versus-host direction improves outcomes after umbilical cord blood transplantation for acute leukemia. Leukemia. 23:492-500.
Zenz, T., D. Mertens, R. Kuppers, H. Dohner, and S. Stilgenbauer. 2010. From pathogenesis to treatment of chronic lymphocytic leukaemia. Nature reviews. Cancer. 10:37-50.
