Resumen de Signaling pathways involved in ram sperm capacitation and apoptosis, and molecular mechanism of protection by seminal plasma components
El uso de la inseminación artificial (IA) en cualquier especie animal requiere el mantenimiento del semen en condiciones no fisiológicas. En la especie ovina, la IA con dosis refrigeradas es más común que con dosis congeladas, debido a los extremadamente bajos resultados de fertilidad obtenidos con semen congelado, lo que está limitando en gran medida el desarrollo del sector. Esto se debe fundamentalmente a la mayor sensibilidad al frío de los espermatozoides ovinos en comparación con los de otras especies. El proceso de criopreservación induce una serie de daños celulares, que incluyen el daño por el frío o cold-shock, el estrés oxidativo y osmótico, y el aumento de marcadores apoptóticos. Se ha encontrado un paralelismo entre algunas de las alteraciones provocadas por el frío en los espermatozoides y los cambios fisiológicos que se producen en su membrana plasmática durante la capacitación, por lo que suele hablarse de una criocapacitación o capacitación prematura, que podría ser una de las causas de la baja fertilidad obtenida con semen ovino congelado. Pero más recientemente se atribuye esta baja fertilidad a la presencia de espermatozoides apoptóticos en dosis seminales congeladas. El conocimiento profundo de los cambios originados por estos procesos es esencial para conseguir una mejora de los protocolos de conservación del semen, aumentando posiblemente la fertilidad obtenida con semen congelado. Por ello, el objetivo general de esta Tesis fue profundizar en el conocimiento de las vías de señalización celular y mecanismos moleculares que participan en la capacitación de espermatozoides ovinos, para poder evitar o minimizar esta capacitación prematura, así como estudiar la posible relación existente entre este proceso y la apoptosis, y su influencia sobre la capacidad fecundante.
Aunque la capacitación espermática ha sido extensamente estudiada en diversas especies de mamíferos, el conocimiento que se tiene de este proceso en el espermatozoide ovino es muy escaso debido a que este espermatozoide no se capacita in vitro en las condiciones en las que lo hacen la mayoría de las especies de mamíferos. En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha realizado grandes avances en la comprensión de los procesos de señalización intracelular que participan en la capacitación de espermatozoides de morueco, centrando su estudio en la vía clásica de la proteín quinasa A (PKA) dependiente de adenosín monofosfato cíclico (cAMP) o ruta cAMP/PKA (Colás et al., 2008; Grasa et al., 2006). Sin embargo, la magnitud de la respuesta capacitante obtenida a través de esta vía en la especie ovina fue moderada en comparación con la descrita para otras especies, lo cual pudiera deberse a una concentración y actividad muy elevadas de fosfodiesterasas intracelulares, que produciría niveles excesivamente bajos de cAMP como para activar la PKA, y sugiere una implicación parcial de esta ruta en la capacitación del espermatozoide ovino (Colás et al., 2008; Grasa et al., 2006).
Continuando con esta línea de investigación, y dado que la regulación de la capacitación en el espermatozoide ovino parece ser diferente a la descrita en otras especies, así como la independencia de algunos de los eventos que tienen lugar en esta célula de la clásica vía cAMP/PKA, como la hiperactivación y la fosforilación de proteínas en residuos de tirosina (Colás et al., 2008; Grasa et al., 2006), sugerimos la hipótesis de que otras vías de señalización intracelular deben de estar implicadas en la capacitación del espermatozoide de esta especie. Concretamente, nuestro primer objetivo fue:
1. Investigar la participación de una nueva ruta de señalización celular, estimulada por el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y mediada por una cascada de MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases). Estudiar la presencia, localización y estado de activación bajo diferentes condiciones de capacitación in vitro de dos de los componentes principales de esta ruta, el receptor para el EGF (EGF-R) y la MAPK ERK 1/2 (Extracellular-signal regulated kinase) en la célula espermática ovina y su posible interacción con la tradicional vía de señalización estudiada mediante cAMP/PKA (Artículo 1).
Asimismo, el estrés oxidativo inducido por un aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) es una de las causas de los daños producidos por la criopreservación. Los niveles de ROS aumentan durante la capacitación de espermatozoides de ratón, que dependen del sistema de defensa antioxidante que utiliza el NADPH generado en la ruta de las pentosas fosfato (RPF) (Urner and Sakkas, 2005). También se ha descrito la implicación de esta ruta en la fertilización de espermatozoides de diferentes especies (Aitken et al., 1995; Urner and Sakkas, 1999; Urner and Sakkas, 2005), y muy recientemente, en la capacitación de espermatozoides humanos (Miraglia et al., 2010), por lo que planteamos la hipótesis de que la RPF fuera funcional y participara también en la capacitación del espermatozoide ovino. Por ello propusimos, 2. Determinar la implicación de la ruta de las pentosas fosfato (RPF) en la capacitación espermática, y su participación en el metabolismo energético, pero fundamentalmente, centrando nuestra atención en su capacidad para generar NADPH, debido al importante papel que éste último tiene como fuente de poder reductor en la protección frente al estrés oxidativo. Investigar la presencia y localización de las dos enzimas clave que modulan la RPF, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH), así como su caracterización cinética/enzimática en espermatozoides ovinos, y estudiar posibles cambios en sus actividades, asociados al proceso de capacitación inducida en presencia tanto de altos niveles de cAMP como promovida por el EGF (Artículo-manuscrito 2).
Existen ciertas semejanzas entre espermatozoides refrigerados y sometidos a capacitación in vitro, y se ha demostrado que ambos procesos, capacitación y refrigeración provocan un aumento de marcadores apoptóticos en espermatozoides ovinos, lo que correlaciona negativamente con la fertilidad obtenida in vivo (Mendoza et al., 2013). Por tanto, se puede hipotetizar que los daños producidos por la refrigeración y la capacitación de espermatozoides ovinos pueden compartir rutas de activación de proteínas relacionadas con la apoptosis, destacando entre ellas las cascadas de MAPKs activadas por estrés celular, que están asociadas al desencadenamiento de la apoptosis en células somáticas (Dhanasekaran and Reddy, 2008; Kyriakis and Avruch, 2012; Sui et al., 2014). Además, la activación de alguna de estas vías ha sido descrita como factor predictivo de una baja calidad espermática (Almog et al., 2008). Por todo ello, y una vez establecida la conexión entre la activación del complejo EGF/EGF-R y la MAPK ERK 1/2 en el espermatozoide ovino, el siguiente objetivo fue 3. Investigar la participación de otras rutas de transducción de señal que también son activadas por el EGF y cuya regulación mediante cascadas de MAPKs es paralela a la responsable de la activación de ERK. Concretamente, nuestro estudio se centra en el módulo JNK (c-Jun N-terminal Kinases) y el grupo de la MAPK p38. Mediante el uso de inhibidores específicos de estas dos proteín quinasas (JNKi y p38i), se investiga su implicación en la capacitación y también en el desencadenamiento de la apoptosis en espermatozoides de morueco, intentando elucidar si estos dos procesos podrían estar compartiendo rutas de señalización. También es interesante abordar el estudio de una posible mediación de las proteínas del plasma seminal (PPS) a través de estos dos módulos de señalización y no únicamente a nivel de la membrana plasmática (Artículo-manuscrito 3).
En anteriores trabajos, nuestro grupo de investigación demostró que las PPS protegen a los espermatozoides frente a los daños del frío (Barrios et al., 2000; Pérez-Pé et al., 2001; Pérez-Pé et al., 2002), y que la hormona melatonina, también presente en el plasma seminal, impide la capacitación prematura producida por el frío y la apoptosis, traduciéndose esta protección en un aumento de la capacidad fecundante valorada mediante ensayos de unión a zona (ZBA, Zona Binding Assays) (Casao et al., 2010; Mendoza et al., 2013).
Por tanto, después de profundizar en el conocimiento de las vías de transducción de señal que regulan la capacitación y esclarecer su posible relación con el desencadenamiento de la apoptosis, sería muy interesante desde el punto de vista práctico para la mejora de la eficiencia de los protocolos de conservación del semen ovino, identificar qué componentes del plasma seminal y a través de qué mecanismo de acción están ejerciendo su efecto protector sobre los espermatozoides ovinos, investigando su posible participación en la capacitación y en el proceso apoptótico. Las PPS de la especie ovina pueden actuar como descapacitantes (Mendoza et al., 2013), y tanto ellas como la melatonina son capaces de evitar el incremento de marcadores apoptóticos tras la inducción de la apoptosis por agentes químicos (Casao et al., 2010; Mendoza et al., 2013). Por tanto, se puede sugerir que la melatonina, las PPS, así como fracciones específicas identificadas y aisladas a partir de las PPS, podrían ejercer efectos beneficiosos incluyéndolas como aditivos en los criodiluyentes. Podrían impedir la capacitación actuando sobre rutas de señalización y otras proteínas implicadas en el proceso apoptótico. En el marco de esta interesante hipótesis, está organizada la segunda parte de esta Tesis Doctoral, dividiendo este objetivo global en varios objetivos parciales:
4. Descubrir si la melatonina ejerce su acción descapacitante y anti-apoptótica sobre el espermatozoide a través de la activación de los receptores transmembrana MT1 y MT2, descritos para esta hormona en el espermatozoide ovino (Casao et al., 2012), o bien mediante la difusión directa (vía soluble) al interior celular debido a su naturaleza anfipática. En el primer caso, se analiza además una posible asociación entre las vías de señalización que se activan a consecuencia de la estimulación de estos receptores, tal y como se ha descrito en células somáticas, y que podrían interactuar con las rutas de transducción de señal anteriormente evidenciadas y asociadas a la capacitación de espermatozoides (Artículo 4).
5. Identificar las fracciones concretas de PPS responsables de este efecto protector sobre los espermatozoides. Estudiar la implicación de las mismas en la adquisición de la capacidad fecundante, mediante la evaluación de la tasa de unión de los espermatozoides a la zona pelúcida, así como la influencia de diferentes condiciones de capacitación in vitro, profundizando en su mecanismo de acción (Artículo 5).
6. Investigar el efecto que las PPS son capaces de ejercer sobre la motilidad espermática, su papel en la adquisición de una motilidad hiperactivada y su relación con la capacitación (Artículo-manuscrito 6).
Globalmente, los estudios propuestos en la presente Tesis Doctoral permiten profundizar en el conocimiento de nuevas vías de transducción de señal que regulan el proceso de capacitación. Algunas de las más importantes se recopilan en el Artículo 7, en el que se presenta una revisión actualizada de los conceptos esenciales asociados a la biología de la membrana plasmática del espermatozoide, así como de los principales mecanismos moleculares implicados en la fisiología espermática, desde la espermatogénesis en los testículos hasta los eventos de fusión entre gametos después de la fecundación. La identificación de esas vías junto con el esclarecimiento de la relación entre apoptosis, capacitación y daños producidos por el frío en el espermatozoide ovino proporcionan un conocimiento básico sobre la fisiología de esta célula que podría ser de utilidad para la mejora de la crioconservación del semen ovino. También se incide en la identificación de posibles candidatos y dianas de futuras investigaciones, como son las proteínas del plasma seminal o la melatonina, que pueden ejercer su efecto protector sobre los espermatozoides mediante su implicación en la capacitación y la apoptosis. En conjunto los resultados esperables podrían ser útiles en la biotecnología de la reproducción ovina ya que proporcionarían una información esencial para la mejora de los protocolos de criopreservación del semen en esta especie, reconduciendo los actuales sistemas de explotación de la especie ovina hacia un sistema plenamente competitivo.
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