Resumen de Desarrollo de técnicas analíticas para el estudio de las proteínas alergénicas arah1 y arah2 de cacahuete (arachis hypogaea) y para su detección en alimentos
La alergia alimentaria constituye actualmente un importante problema de salud pública en los países desarrollados debido a su alta prevalencia (1-3% en adultos y 6-8% en niños) y al aumento que está experimentando en los últimos años. La alergia al cacahuete merece especial atención puesto que es el causante de un importante porcentaje de los casos de alergias alimentarias. Además, suele persistir de por vida, y a pequeñas dosis suele desencadenar una reacción alérgica con una sintomatología grave que puede llegar a producir un choque anafiláctico.
Las proteínas Ara h1 y Ara h2 son considerados los principales alérgenos del cacahuete, puesto que más del 90% de las personas alérgicas tienen IgE específicas frente a ellas. Además, las proteínas Ara h1 y Ara h2 son cuantitativamente importantes, puesto que representan entre el 12 y el 16% y entre el 5,9 y 9,3 del contenido total de la proteína de la semilla, respectivamente.
Las técnicas inmunoquímicas para la detección de proteínas alergénicas son muy usadas actualmente en el control de calidad tanto en la industria alimentaria como por los organismos de control alimentario. Estas técnicas presentan una alta sensibilidad y especificidad, además de ser sencillas, rápidas y de bajo coste. Sin embargo, hay que considerar que, cuando estas técnicas van a ser aplicadas en el análisis de alimentos procesados, los tratamientos tecnológicos aplicados pueden desnaturalizar las proteínas diana e inducir su agregación, lo que puede alterar su solubilidad y/o destruir o enmascarar las zonas que son reconocidas por sus anticuerpos específicos.
El objetivo global de esta tesis ha sido desarrollar técnicas inmunoquímicas para la determinación de las proteínas alergénicas de cacahuete (Ara h1 y Ara h2) que permitan por una parte, estudiar el efecto que los tratamientos tecnológicos utilizados en la industria alimentaria tienen en su desnaturalización, y por otra parte, aplicar las técnicas desarrolladas para detectar la presencia de cacahuete en alimentos modelo procesados.
Para ello, las proteínas Ara h1 y Ara h2 se han purificado a partir de cacahuete crudo mediante técnicas de precipitación salina y cromatográficas, y se han obtenido antisueros frente a ellas mediante inoculación en conejos. Los anticuerpos específicos se han aislado por inmunoadsorción, se han conjugado con peroxidasa y se han utilizado para desarrollar técnicas de ELISA de tipo sandwich y de tipo competitivo directo para cada proteína. Los límites de detección para los formatos de tipo sándwich y competitivo son de 0,10 y 0,09 mg/kg para la Ara h1 y de 0,11 y 0,14 mg/kg para la Ara h2, respectivamente. Además, se ha desarrollado una técnica de inmunocromatografía para la detección de la proteína Ara 1, que tiene un límite de detección de 30 ng/mL.
Por otra parte se ha llevado a cabo la selección de péptidos y fagos afines por la proteína Ara h2 mediante la técnica de expresión fago, utilizado una biblioteca comercial de péptidos aleatorios expresados en bacteriófagos. Sin embargo, dado que tanto el péptido como los fagos seleccionados afines a la proteína Ara h2 muestran reacción con otras matrices alimentarias, no pueden ser usados para la detección de cacahuete en alimentos por su falta de especificidad.
La termorresistencia de la proteína Ara h1 se ha estudiado determinando su pérdida de inmunorreactividad tras someterlas a diferentes temperaturas (entre 82 y 90 ºC) y tiempos de tratamiento en tubos capilares. Además, la estabilidad térmica de la Ara h1 se ha estudiado también mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Con los datos obtenidos se han calculado los parámetros cinéticos y termodinámicos de su desnaturalización. Por otra parte, se ha determinado la hidrofobicidad, el número de grupos sulfidrilo libres y el perfil electroforético en muestras de proteína Ara h1 tras someterla a tratamientos térmicos de diferente intensidad.
El proceso cinético de desnaturalización de la proteína Ara h1, entendido como la pérdida de la capacidad de la proteína de ser reconocida por sus anticuerpos específicos debido al tratamiento térmico, se ve favorecido al aumentar la temperatura y el tiempo de tratamiento, y el mejor ajuste se obtiene asumiendo un orden de reacción aparente de n =1,5. Los altos valores del incremento en la entalpía de activación (732 kJ/mol) y los valores positivos de la entropía de activación indican que, durante la desnaturalización, dicha proteína sufre un cambio de conformación considerable, y que los procesos de desplegamiento predominan sobre los de agregación en el rango de temperaturas estudiado.
Mediante la técnica de calorimetría diferencial de barrido, se han obtenido unos valores para la temperatura máxima del pico de desnaturalización y de la entalpia de desnaturalización por extrapolación a una velocidad de calentamiento de 0 ¿C/min de 90,22 ¿C y 1.574 kJ/mol respectivamente.
La aplicación de tratamientos de diferente intensidad a la proteína Ara h1 produce cambios en su estructura que aumentan ligeramente su hidrofobicidad. Además, el tratamiento térmico de mayor intensidad aplicado (90 ¿C, 10 min) da lugar a la exposición de dos grupos sulfidrilo, y conduce a la formación de agregados por interacciones covalentes.
Se ha estudiado también el efecto que tiene el tratamiento de altas presiones hidrostáticas en la desnaturalización de la proteína Ara h1 tratada en tampón y en un extracto de proteínas de cacahuete. La desnaturalización de la proteína Ara h1 determinada como la pérdida de reactividad con sus anticuerpos específicos, es muy baja a 200 y 300 MPa, y a presiones de 400 MPa y superiores, se produce una marcada desnaturalización que tiene lugar en los primeros minutos del tratamiento. El grado de desnaturalización es similar al tratar la proteína purificada en tampón y en un extracto de cacahuete. Además, los cambios producidos en la estructura de la Ara h1 disminuyen ligeramente su hidrofobicidad, inducen la exposición de grupos sulfidrilo y la formación de agregados por interacciones covalentes que comienzan a apreciarse a una presión de 400 MPa.
El efecto de la adición a las muestras de los reactivos N-etilmaleimida y KIO3 antes del tratamiento con altas presiones muestra como el reactivo NEM tiene un efecto protector en la desnaturalización de la proteína Ara h1 que parece deberse al bloqueo de los grupos sulfidrilo libres de la proteína, lo que previene su agregación mediante enlaces covalentes. Por el contrario, en presencia de KIO3 aumenta su desnaturalización y se inhibe su agregación por enlaces covalentes debido probablemente a la oxidación de los grupos sulfidrilo libres de la proteína. La presencia de estos reactivos no previene la agregación de la proteína mediante interacciones no covalentes.
Por otra parte, las técnicas desarrolladas de ELISA en placa y de inmunocromatografía se han utilizado en el análisis de alimentos modelo procesados que habían sido elaborados utilizando como ingrediente diferentes porcentajes de manteca de cacahuete. Para la técnica de ELISA, los formatos de tipo competitivo directo han mostrado tener una mayor sensibilidad que los correspondientes formatos de tipo sándwich para la detección de las proteínas Ara h1 y Ara h2. Además, los ensayos de ELISA de tipo sándwich y competitivo directo basados en la determinación de la proteína Ara h2 tienen una mayor sensibilidad que los basados en la determinación de la proteína Ara h1 para detectar la presencia de cacahuete en galletas modelo. El formato de ELISA de tipo competitivo directo para la Ara h2 ha permitido detectar la adición de un 0,05% de cacahuete en galletas modelo.
La técnica de inmunocromatografía permite detectar la presencia de un 0,01% de cacahuete en galletas modelo y de un 0,05% en muestras de chocolate, por lo que resulta más sensible que las técnicas de ELISA en placa desarrolladas para la misma proteína.
La técnica de ELISA de tipo competitivo directo ha sido objeto de un estudio interlaboratorial en el que han participado cuatro laboratorios, obteniéndose unos resultados adecuados en términos de repetibilidad (RSDr) y reproducibilidad (RSDR), con valores que oscilan entre 15,83 y 44,07%, y entre 30,18 y 111,13% respectivamente.
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