The reductase activity of the human apoptosis inducing factor: molecular bases and implications in the enzyme apoptotic function
- Autores: Raquel Villanueva Llop
- Directores de la Tesis: Patricia Ferreira Neila (dir. tes.), Milagros Medina Trullenque (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Antonio Navarro Carruesco (presid.), Maria Isabel Marzo Rubio (secret.), Rita Ruth Bernhardt (voc.)
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
¿ INTRODUCCIÓN El Factor de Inducción de Apoptosis (AIF) es una flavoenzima mitocondrial filogenéticamente conservada y presente en todos los reinos primarios que comparte homología con diferentes familias de reductasas 1, 2. Esta proteína tiene una doble función celular: (i) En la mitocondria, presenta una actividad oxido-reductasa dependiente de NADH a través de su cofactor flavínico (FAD) que induce su dimerización 3, 4. En este orgánulo AIF también contribuye a la estabilidad de los complejos I y III de la cadena de transporte electrónico 5. Sin embargo, a fecha de hoy no está claro ni su función celular como oxido-reductasa, ni cómo proporciona estabilidad a los mencionados complejos mitocondriales; (ii) Tras un estímulo inductor de muerte, AIF se libera de la mitocondria, se transloca al núcleo e induce la cromatinolisis típica de la muerte independiente de caspasas: condensación parcial de la cromatina y degradación del DNA en fragmentos de 50 Kb 1. Existe cierta controversia sobre la relación entre las dos funciones de AIF ya que algunos autores sugieren que el estado de oxido-reducción de AIF tiene una influencia clave en la conformación de la proteína y por extensión en la función proapoptótica de AIF 4, 6, 7. Así, el estudio a nivel molecular de las propiedades de oxido-reducción de AIF resulta clave en el análisis del papel de este factor proapoptótico.
¿ DESARROLLO TEÓRICO Mi proyecto de tesis se ha centrado en la comprensión del papel celular de la proteína mitocondrial AIF humana (hAIF). Particularmente el objetivo final es comprender las bases moleculares de la actividad reductasa de hAIF y su implicación en la función apoptótica de esta proteína. Para ello he sobreexpresado y purificado hAIF. He identificado residuos clave para su actividad reductasa así como para el proceso de dimerización. Utilizando aproximaciones tanto in vivo como in vitro he determinado la relación entre la actividad reductasa de AIF y su función apoptótica. Finalmente, he identificado compuestos unidores de hAIF analizando su efecto en las funciones de la proteína.
Se han generado distintas variantes de AIF con propiedades de oxido-reducción diferentes a la enzima nativa. Así, variantes de los residuos P173, K177, F310, E314, H454 y W483 en hAIF han puesto de manifiesto el papel de éstos en la modulación del complejo catalíticamente competente para el proceso de transferencia de hidruro entre el coenzima NADH y el anillo flavínico de AIF, la eficiencia en el proceso de transferencia de hidruro y la reactividad de AIF reducida frente al oxígeno 8. También se ha generado una variante triple de hAIF, para los residuos de la interfase de dimerización E413/R422/R430, que impide la dimerización de la proteína asociada al proceso de transferencia de hidruro y que desestabiliza considerablemente la formación del complejo 9. La introducción de esta mutación en células sugiere que también modifica la función apoptótica de la proteína.
hAIF, como actor implicado en la regulación de la muerte celular y en el desarrollo de mitocondriopatías humanas causadas por mutaciones en la proteína 10-15, se presenta como una potencial diana terapéutica. Las estrategias actuales en el estudio de hAIF están encaminadas a la búsqueda de moduladores de la actividad apoptótica de la proteína. Una de las posibilidades de modulación de hAIF implica la regulación de su actividad redox, que llevaría como consecuencia la regulación de la actividad proapoptótica. Mediante métodos de cribado experimental de alto rendimiento basados en la alteración de la estabilidad térmica de AIF al unírsele un ligando, se han identificado 11 compuestos de dos quimiotecas comerciales (más de 11.000 moléculas de pequeño tamaño que cumplen al 100% la normativa para convertirse en potenciales fármacos) capaces de unir hAIF. De éstos, se han seleccionado los que, representando estructuras divergentes, producen una mayor alteración de la estabilidad de AIF.
En el transcurso de dos estancias en el Centre de Recherche des Cordeliers en París me familiaricé con diversas metodologías de cultivo celular y análisis del desarrollo celular. La confrontación de mutantes con núcleos purificados permitió concluir que aquellas variantes con comportamiento redox alterado no ejercen sobre los núcleos los mismos efectos que hAIF nativa. Este comportamiento se confirmó mediante otras técnicas, cuyos resultados sugieren que para completar el proceso de muerte celular es necesario que se produzca la dimerización de la proteína. A fecha de hoy, estos resultados indican que las actividades reductasa y apoptótica de hAIF se encuentran relacionadas.
¿ CONCLUSIÓN Este proyecto se ha desarrollado en un marco multidisciplinar, dentro de mi propio grupo de investigación y en colaboración con otros grupos de investigación nacionales e internacionales. He aprendido a combinar técnicas de bioquímica, biofísica y biología molecular como cultivos, purificación de proteínas, medidas de cinéticas rápidas, técnicas espectroscópicas, de cultivo celular y de biología estructural. Así mismo, he trabajado en colaboración directa con otros investigadores especialistas en métodos biofísicos como la cristalografía de rayos X o la microscopía de fuerzas atómicas con objeto de comprender el funcionamiento de las dos actividades de hAIF desde un punto de vista estructural, su posible modulación y la relación entre ambas. La mayor parte de los objetivos propuestos al inicio de esta tesis se han cumplido, además de otros que se han ido incorporando a lo largo de su desarrollo.
¿ BIBLIOGRAFÍA 1. Susin, S. A., Lorenzo, H. K., Zamzami, N., Marzo, I., Snow, B. E., Brothers, G. M., Mangion, J., Jacotot, E., Costantini, P., Loeffler, M., Larochette, N., Goodlett, D. R., Aebersold, R., Siderovski, D. P., Penninger, J. M., and Kroemer, G. (1999) Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor, Nature 397, 441-446.
2. Lorenzo, H. K., Susin, S. A., Penninger, J., and Kroemer, G. (1999) Apoptosis inducing factor (AIF): a phylogenetically old, caspase-independent effector of cell death, Cell Death Differ 6, 516-524.
3. Mate, M. J., Ortiz-Lombardia, M., Boitel, B., Haouz, A., Tello, D., Susin, S. A., Penninger, J., Kroemer, G., and Alzari, P. M. (2002) The crystal structure of the mouse apoptosis-inducing factor AIF, Nat Struct Biol 9, 442-446.
4. Sevrioukova, I. F. (2009) Redox-linked conformational dynamics in apoptosis-inducing factor, J Mol Biol 390, 924-938.
5. Vahsen, N., Cande, C., Briere, J. J., Benit, P., Joza, N., Larochette, N., Mastroberardino, P. G., Pequignot, M. O., Casares, N., Lazar, V., Feraud, O., Debili, N., Wissing, S., Engelhardt, S., Madeo, F., Piacentini, M., Penninger, J. M., Schagger, H., Rustin, P., and Kroemer, G. (2004) AIF deficiency compromises oxidative phosphorylation, Embo J 23, 4679-4689.
6. Sevrioukova, I. F. (2011) Apoptosis-inducing factor: structure, function, and redox regulation, Antioxid Redox Signal 14, 2545-2579.
7. Churbanova, I. Y., and Sevrioukova, I. F. (2008) Redox-dependent changes in molecular properties of mitochondrial apoptosis-inducing factor, J Biol Chem 283, 5622-5631.
8. Villanueva, R., Ferreira, P., Marcuello, C., Usón, A., Miramar, M. D., Peleato, M. L., Lostao, A., Susin, S. A., and Medina, M. (2015) Key Residues Regulating the Reductase Activity of the Human Mitochondrial Apoptosis Inducing Factor, Biochemistry 54, 5175-5184.
9. Ferreira, P., Villanueva, R., Martínez-Júlvez, M., Herguedas, B., Marcuello, C., Fernandez-Silva, P., Cabon, L., Hermoso, J. A., Lostao, A., Susin, S. A., and Medina, M. (2014) Structural insights into the coenzyme mediated monomer-dimer transition of the pro-apoptotic apoptosis inducing factor, Biochemistry 53, 4204-4215.
10. Ghezzi, D., Sevrioukova, I., Invernizzi, F., Lamperti, C., Mora, M., D'Adamo, P., Novara, F., Zuffardi, O., Uziel, G., and Zeviani, M. (2010) Severe X-linked mitochondrial encephalomyopathy associated with a mutation in apoptosis-inducing factor, Am J Hum Genet 86, 639-649.
11. Berger, I., Ben-Neriah, Z., Dor-Wolman, T., Shaag, A., Saada, A., Zenvirt, S., Raas-Rothschild, A., Nadjari, M., Kaestner, K. H., and Elpeleg, O. (2011) Early prenatal ventriculomegaly due to an AIFM1 mutation identified by linkage analysis and whole exome sequencing, Mol Genet Metab 104, 517-520.
12. Rinaldi, C., Grunseich, C., Sevrioukova, I. F., Schindler, A., Horkayne-Szakaly, I., Lamperti, C., Landoure, G., Kennerson, M. L., Burnett, B. G., Bonnemann, C., Biesecker, L. G., Ghezzi, D., Zeviani, M., and Fischbeck, K. H. (2012) Cowchock syndrome is associated with a mutation in apoptosis-inducing factor, Am J Hum Genet 91, 1095-1102.
13. Kettwig, M., Schubach, M., Zimmermann, F. A., Klinge, L., Mayr, J. A., Biskup, S., Sperl, W., Gärtner, J., and Huppke, P. (2015) From ventriculomegaly to severe muscular atrophy: Expansion of the clinical spectrum related to mutations in AIFM1, Mitochondrion 21C, 12-18.
14. Diodato, D., Tasca, G., Verrigni, D., D'Amico, A., Rizza, T., Tozzi, G., Martinelli, D., Verardo, M., Invernizzi, F., Nasca, A., Bellacchio, E., Ghezzi, D., Piemonte, F., Dionisi-Vici, C., Carrozzo, R., and Bertini, E. (2015) A novel AIFM1 mutation expands the phenotype to an infantile motor neuron disease, Eur J Hum Genet.
15. Ardissone, A., Piscosquito, G., Legati, A., Langella, T., Lamantea, E., Garavaglia, B., Salsano, E., Farina, L., Moroni, I., Pareyson, D., and Ghezzi, D. (2015) A slowly progressive mitochondrial encephalomyopathy widens the spectrum of AIFM1 disorders, Neurology 84, 2193-2195.
