Helicobacter pylori: eventos biomoleculares asociados a la aparición de resistencia y al mecanismo de intercambio anión/agua en la superficie de flavodoxina. Diseño y optimización de nuevos compuestos con actividades farmacológicas
- Autores: Juan José Galano Frutos
- Directores de la Tesis: Javier Sancho Sanz (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Milagros Medina Trullenque (presid.), Jorge Gálvez Álvarez (secret.), Ignacio Faustino Plo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
- Menciones:
- Europea
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
El trabajo descrito a lo largo de la presente Tesis Doctoral es un compendio de estudios diversos sobre Cuestiones científicas y de aplicación, cuyo denominador común es la bacteria Helicobacter pylori (H. pylori ). H. pylori es un bacilo Gram-negativo capaz de alojarse en las mucosas gástrica e intestinal del ser humano y de causar daños que van desde una simple gastritis, hasta algunos más severos como linfomas, cáncer y la muerte en casos en los que no es bien controlado o tratado a tiempo. Más de la mitad de la población mundial se estima es portadora de este microorganismo, llegándose a alcanzar índices de prevalencia superiores al 70% en países poco desarrollados, especialmente de África y Asia. Los factores propios de virulencia de H. pylori (dependen del tipo de cepa en cuestión), así como factores externos, como por ejemplo los hábitos de higiene, la alimentación, el consumo de alcohol y tabaco, y/o el uso indiscriminado de antibióticos, hacen que varíe notoriamente por regiones, edades y estatus socio-económicos. En los últimos años, uno de estos factores, el uso indiscriminado de antibióticos, ha complicado el panorama, dado que han comenzado a aumentar significativamente las tasas de resistencia a los medicamentos que más comúnmente venían siendo utilizados para combatir a H. pylori. En uno de los trabajos realizados durante el desarrollo de esta tesis, este problema es abordado en colaboración con investigadores de Gambia, EE.UU. y el Reino Unido. El objetivo del estudio radicó en establecer las tasas de resistencia a los antibióticos amoxicilina, claritromicina, eritromicina, metronidazol y tetraciclina en cepas de H. pylori extraídas a ciudadanos de un país ubicado en África Occidental, Gambia; así como en analizar -desde un punto de vista mutacional/funcional- la relación existente entre el estatus de resistencia o susceptibilidad a dichos antibióticos y las mutaciones observadas en los componentes biológicos que se asocian a la aparición de resistencia en H. pylori (la enzima nitrorreductasa RdxA en el caso de metronidazol y el RNA ribosomal 16S rRNA en el caso de tetraciclina). El monitoreo de los niveles de resistencia y las estadísticas calculadas en estudios de este tipo son importantes para médicos y/o responsables de salud en la toma de decisiones en relación con el uso, venta y/o prescripción médica de estos medicamentos. Por otro lado, nuestra hipótesis al realizar el análisis mutacional/funcional estuvo basada en la idea de que modelando tridimensionalmente los cambios estructurales producidos por las mutaciones observadas en RdxA es posible explicar el estatus de resistencia presente en dichas cepas. En este sentido, criterios de distancia al sitio de unión del FMN y a la interfase de dimerización de RdxA, y otros para decidir cuándo una sustitución puede afectar la estabilidad de la proteína o la interacción con el cofactor FMN, o cuándo una sustitución no está permitida por motivos estéricos, son establecidos para el análisis. Siguiendo esta idea, a partir de las mutaciones observadas en RdxA pudimos dar una explicación con base racional al estatus presentado por la mayora de las cepas de H. pylori frente a metronidazol, lo cual demuestra la utilidad del enfoque propuesto para análisis similares futuros. Análisis de este tipo podrían contribuir también a entender mejor los roles de RdxA y su homóloga FrxA en hacer susceptible a H. pylori frente a este antibiótico, así como en el metabolismo de esta bacteria.
El incremento de las tasas de resistencia a antibióticos, unido a la posibilidad de contar con una reconocida diana terapéutica en H. pylori, la flavodoxina, y el conocimiento previo de 3 compuestos cabezas de serie con poder bactericida sobre este microorganismo motivó la realización de un trabajo posterior. En este trabajo nos propusimos optimizar las propiedades farmacológicas de estos 3 compuestos líderes para identificar nuevos candidatos con actividad específica contra H. pylori que pudieran constituirse en alternativas viables contra esta bacteria. Un diseño/optimización racional a doble vuelta fue llevado a cabo. Inicialmente son dentificados por similaridad estructural grupos de derivados de cada uno de los 3 cabezas de serie disponibles, los cuales posteriormente son cribados a través de un ensayo -puesto a punto también en un trabajo previo- basado en el aumento de la temperatura media de desnaturalización, Tm. Los derivados cribados son entonces ensayados para evaluar su afinidad por la flavodoxina, su poder inhibitorio frente a H. pylori y su toxicidad sobre células HeLa.
A partir de estos datos, son identificados nuevos compuestos con poder bactericida e índices terapéuticos mejorados (Índice Terapéutico = Mínima Concentración Citotóxica/Mínima Concentración Inhibitoria), propiedad esta ultima muy importante dado que constituye una medida de la factibilidad del compuesto para ser empleado con eficacia y teniendo un mínimo de toxicidad. Tal hallazgo nos permite extraer información estructural relevante en relación con las propiedades ensayadas, la cual es utilizada en una segunda ronda de optimización. Nuevas variantes son diseñadas entonces y enviadas a sintetizar para su posterior ensayo. Los resultados permiten identificar nuevos compuestos con poder bactericida e índices terapéuticos aumentados en hasta 60 veces.
Finalmente, 11 nuevos candidatos con bajo peso molecular y propiedades terapéuticas prometedoras son revelados en este estudio. Estos compuestos representan una oportunidad interesante para desarrollar nuevos antibióticos con actividad específica contra H. pylori, aunque, por supuesto, deberán ser evaluados en modelos animales.
Dos de los tres cabezas de serie previamente identificados presentaron cierta similaridad estructural (poseen la subestructura común [(E)-2-R-vinil]benceno). Ello nos permitió disponer -a partir del estudio anterior- de un conjunto de 24 compuestos análogos con afinidad por la flavodoxina de H. pylori y con las actividades biológicas antes mencionadas ensayadas que posibilitó la realización de un estudio QSAR clásico (del inglés Quantitative Structure Activity Relationship) para obtener modelos que nos permitiesen entender mejor las relaciones estructura/actividad-biológica presentes en los derivados identificados y con ello poder llevar a cabo -con una base más racional mejoras adicionales de sus propiedades. Para llevar a cabo este estudio nos propusimos seleccionar cuidadosamente un grupo de descriptores moleculares que fuesen representativos de propiedades físico-químicas, electrónicas, estéricas o hidrofóbicas, que son las que, en general, determinan la efectividad de un fármaco. Asimismo, pretendimos que estos descriptores fuesen lo suficientemente sencillos para poder desentrañar sin muchas complicaciones la información estructural que ellos encierran por definición. Varios análisis y técnicas modernas de regresión y validación como por ejemplo, algoritmos genéticos, Y-scrambling y pruebas de predictibilidad sobre las series interna y externa, son empleadas para asegurar la calidad de los modelos. Como resultado son obtenidos modelos QSAR de calidad para predecir la afinidad (Ka) y el poder inhibitorio (MIC) de los compuestos, mientras que, no es posible obtener modelos fiables que permitan explicar racionalmente las toxicidades e índices terapéuticos de los mismos.
Los modelos QSAR desarrollados constituyen herramientas útiles para el diseño de nuevos y mejores candidatos con actividad específica contra H. pylori. Los mismos serán utilizados en nuevas rondas de optimización de los compuestos de partida.
Finalmente, en un estudio teórico hemos querido dar continuidad a una serie de trabajos previos realizados en nuestro grupo en relación con el fenómeno de interacción cofactor/apoproteína en la proteína transportadora de electrones flavodoxina de H. pylori (utilizada como diana terapéutica en los dos trabajos previos). La importancia de estudiar este fenómeno radica en la amplia variedad de flavodoxinas que han sido identificadas (generalmente en organismos procariotas, pero también en algunos tipos de algas eucariotas1), así como en el rol esencial que desempeña el cofactor FMN en la función de estas enzimas que, en general, son también esenciales para el metabolismo de los organismos que la portan. En los trabajos previos, estudios de mutagénesis dirigida, de cinética, o incluso computacionales han sido implementados para estudiar el mecanismo de interacción FMN/apo-Hp-Fld. A partir de ellos, se ha podido concluir sobre aspectos importantes como por ejemplo el sitio del cofactor y el orden a través del cual este compuesto se une a la proteína. Sin embargo, aspectos como la observación de cinéticas bifásicas o la presencia de aniones coordinados en el sitio de unión del fosfato del FMN cuando este cofactor todavía no se ha unido, constituyen interrogantes que deben ser aún bordadas para el total esclarecimiento del mencionado mecanismo.
En el estudio realizado, la última de estas cuestiones es investigada a través de simulaciones de Dinámica Molecular. La observación de la liberación al solvente de un anión cloruro que se encontraba imitando al grupo fosfato del cofactor en un número de simulaciones exploratorias sobre la apo-Hp-Fld dió pie a la realización de un número mayor de simulaciones (60 en total). Lo anterior nos permitió obtener mejores estadísticas del fenómeno observado y posibilitó también investigar el papel del solvente en la salida del cloruro de su sitio de unión. Nuestra hipótesis aquí consistió en identificar el orden de eventos en el que tiene lugar dicha salida. En otras palabras, identificar si la entrada de moléculas de agua a la primera capa de solvatación de cloruro ocurre a priori o a posteriori de los eventos de ruptura de puentes de hidrógeno entre el anión y los residuos de la proteína. Con este objetivo en mente, fueron establecidas definiciones y algoritmos precisos para el registro de los eventos moleculares que tienen lugar durante la salida de cloruro, e implementados varios análisis sobre las trayectorias obtenidas. Uno de estos análisis consistió en calcular la coordinación del cloruro, diferenciando entre la coordinación proveniente de moléculas de agua y la proveniente de residuos de proteína. Lo anterior permite observar si durante la liberación del anión aumenta o no su coordinación total, y si ocurre primero la disminución de la coordinación cloruro/proteína que el aumento de la coordinación cloruro/agua. Otro análisis realizado estuvo basado exclusivamente en monitorear las distancias de interacción cloruro/agua vs. las de cloruro/residuos; y un tercero en obtener una estadística general de la relatividad temporal con la que ocurren los mencionados eventos a partir de agrupar en forma de histogramas secciones definidas de trayectorias en las que se observa una ruptura cloruro/residuo. Adicionalmente, análisis complementarios de los tiempos de residencia de agua, tanto en la primera capa de solvatación de cloruro como en el sitio de unión del anión, son efectuados. Todos estos análisis, conjuntamente, han permitido arribar a la conclusión de que no es el solvente quien determina la salida del anión hacia el bulk.
De este modo, es propuesto un mecanismo en el que las interacciones del anión con la apoproteína (enlaces de hidrógeno) son sucesiva y espontáneamente rotas y donde moléculas de agua ocupan las valencias libres surgidas tanto en el cloruro como en la apoproteína tras cada una de estas rupturas. En este sentido, y dado que es coherente con los datos y observaciones obtenidas en los estudios previos mencionados, el mecanismo propuesto sugiere un escenario para la unión FMN/apo-Hp-Fld donde una vez que el cofactor se encuentra parcialmente unido a través de su anillo de isoaloxazina debe esperar oportunamente a que sea liberado cualquier anión unido en el sitio del fosfato para completar su unión. La presencia de aniones imitando al grupo fosfato del cofactor FMN ha sido también observada en otras flavodoxinas similares como la de Anabaena. Hemos efectuado simulaciones exploratorias sobre esta proteína pero no ha sido posible observar, al menos en tiempos de hasta 100 ns de simulación, la salida del sulfato. Si esto fuese posible de algún modo en el futuro, un enfoque como el utilizado aquí para estudiar el proceso de desunión cloruro/apoproteína podría ser útil para verificar el escenario que proponemos en relación con la presencia de estos aniones y su implicación en el proceso de unión de FMN a la proteína.
