Resumen de Estudio de la resistencia al calor de las principales bacterias patógenas de interés en alimentos
Como es bien sabido, el tratamiento térmico de los alimentos tiene la ventaja frente a otros métodos de conservación tradicionales de que actúa inactivando a los microorganismos de una forma previsible. Esta previsibilidad hace posible el cálculo matemático de los criterios de proceso necesarios para garantizar un nivel de inactivación concreto. Es por este motivo que los tratamientos térmicos son seguramente la tecnología más extendida en las industrias de conservación de los alimentos, especialmente cuando la calidad microbiológica de la materia prima no está totalmente garantizada, que es casi siempre.
El calor, cuyas ventajas son indiscutibles, presenta el inconveniente de su inespecificidad. Al aplicar un tratamiento térmico, al tiempo que se inactivan los agentes de alteración, se provocan cambios en algunos de los componentes de los alimentos que conducen a la pérdida de algunas de sus cualidades nutritivas y de sus propiedades sensoriales. Aunque se ha avanzado notablemente en la optimización de los tratamientos térmicos aprovechando la distinta termodependencia de los cambios y mejorando los sistemas de calentamiento, el problema sigue persistiendo, y resulta de interés realizar un estudio que siente las bases para lograr esa mejora.
Para realizar este estudio, se escogieron cuatro especies bacterianas de interés sanitario (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica y Listeria monocytogenes), y tras llevar a cabo una extensa revisión bibliográfica se observó que, además de existir una amplias diferencias en termorresistencia entre especies, las diferencias entre cepas de la misma especie eran un aspecto a tener en cuenta. Por otra parte, se observó que, de entre los factores que afectan a la termorresistencia microbiana, pH y actividad de agua del medio de tratamiento son los más importantes.
Además, es un hecho demostrado que la cinética de inactivación por calor no siempre sigue un ritmo exponencial, apareciendo en ocasiones desviaciones cuya cuantificación resulta importante a la hora de diseñar los tratamientos térmicos. Para poder hacer comparaciones acerca de la influencia de pH y actividad de agua del medio de tratamiento (así como de sus posibles interacciones) y de la influencia del factor especie/cepa tanto sobre la termorresistencia como sobre la cinética de inactivación, sería de mucha utilidad el desarrollar un modelo terciario general que permitiese hacer interpolaciones y comparaciones directas.
Además, si se pretende que los datos obtenidos en una investigación de este tipo tengan aplicación directa en el sector industrial, deberían incluirse determinaciones de termorresistencia en alimentos de características diversas. Estos estudios nos permitirían, como mínimo, saber si existen en los alimentos otros factores, distintos del pH y la actividad de agua, que determinen de forma relevante la cinética de inactivación y los criterios de proceso de los tratamientos diseñados para su inactivación.
Obviamente, aunque existen muchísimas más cuestiones, todavía sin resolver, de gran interés, el objetivo principal de esta investigación fue realizar una caracterización termobacteriológica de las especies de bacterias vegetativas patógenas de interés en Tecnología de los Alimentos. Para conseguir este objetivo se consideró necesario:
¿ Establecer la cinética de inactivación, seleccionar un modelo primario, otro secundario y otro terciario que permitan establecer los parámetros de termorresistencia más adecuados para realizar comparaciones en distintas condiciones.
¿ Establecer la importancia de las variaciones inter e intraespecíficas de cada una de las especies objeto de estudio ¿ Objetivar la influencia del pH y la actividad de agua en la termorresistencia de las cepas más resistentes de cada una de las especies estudiadas, así como de sus posibles interacciones.
¿ Determinar si los resultados obtenidos en medios de laboratorio permiten predecir el comportamiento microbiano en alimentos de características diversas y, en su caso, establecer cuál es la magnitud esperable del error.
Por último, y de manera paralela al estudio termobacteriológico básico, se consideró de interés explorar algunos aspectos fisiológicos de relevancia en la supervivencia bacteriana al calor, aportando conocimientos en este campo. Por ello se plantearon los siguientes objetivos adicionales:
¿ Caracterizar la presencia de fenómenos de daño y recuperación celular en Listeria monocytogenes tratadas en matrices alimentarias.
¿ Contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares implicados en la inactivación celular, mediante el estudio de la formación de especies reactivas del oxígeno y la permeabilización de la membrana celular en dos cepas de Salmonella, termorresistente y termosensible, tratadas por el calor.
Para este estudio se utilizaron 5 cepas de cada una de las 4 especies seleccionadas. Las cepas fueron suministradas por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) o la American Type Culture Collection (ATCC). Las determinaciones de resistencia al calor se llevaron a cabo en un termorresistómetro TR-SC. Los tratamientos térmicos se llevaron a cabo en tampón Mc Ilvaine de distinto pH (7,0-4,0) y actividad de agua (0,99-0,94), que se ajustó con glicerol. Una vez llevadas a cabo las determinaciones de resistencia al calor en medios laboratoriales, se procedió a determinar la termorresistencia en cuatro matrices alimentarias (caldo de pollo, caldo de verduras, zumo de manzana y zumo de naranja). En algunas de las condiciones se llevaron a cabo estudios sobre fenómenos de daño a la membrana o generados a causa del estrés oxidativo.
Los resultados de esta investigación han puesto de manifiesto la extraordinaria variabilidad, no sólo en termorresistencia de las distintas cepas y especies, sino también en el comportamiento de cada microorganismo. Esta enorme variabilidad es, de hecho, mayor que la observada en investigaciones de diseño similar con otras tecnologías no térmicas. Esta observación parece indicar que el mecanismo de inactivación por calor es más complejo que el de la inactivación por otras tecnologías. Por esta razón, de intentar incluir en este apartado todas las conclusiones particulares llegaríamos a elaborar una lista demasiado extensa, por lo que se ha decidido incluir aquí sólo aquellas que pueden generalizarse, al menos hasta cierto nivel. El resto de conclusiones características de cada especie pueden consultarse en el texto original.
De nuestra investigación pueden extraerse las siguientes conclusiones generales:
¿ Las gráficas de supervivencia obtenidas bajo todas las condiciones experimentales, muestran una cinética de inactivación lineal o lineal con presencia de hombro, no observándose fenómenos de cola en el rango estudiado (hasta 4 reducciones logarítmicas). La ecuación de Geeraerd ajusta bien los recuentos de supervivientes en todos los casos por lo que puede considerarse un modelo primario adecuado.
¿ El modelo secundario, a partir del cual se calcula el valor z, puede obtenerse representando, frente a la temperatura, la pendiente del tramo recto de las gráficas de supervivencia, o alternativamente el tiempo necesario para conseguir un determinado nivel de inactivación (gráficas TDT), ya que ambos valores no difieren significativamente.
¿ El modelo terciario desarrollado con S. aureus indica que el efecto del pH sobre la termorresistencia sigue una relación polinomial, mientras que el efecto de la aw es lineal. Dicho modelo permite predecir adecuadamente los tiempos de tratamiento necesarios para conseguir la inactivación de cuatro ciclos logarítmicos tanto en S. aureus como en los otros tres microorganismos, bajo distintas condiciones de pH, aw y temperatura.
¿ En las cuatro especies existe una notable variabilidad en la resistencia al calor de las distintas cepas, que es superior en Salmonella enterica debido a la gran termorresistencia de la cepa Senftenberg 775W. Obviando esta cepa particular, la variabilidad intraespecie determina que se necesiten entre 2 y 8 veces más tiempo de tratamiento para alcanzar el mismo nivel de inactivación de las cepas más resistentes que de las más sensibles, dependiendo del medio de tratamiento y de la especie. Además, la cepa más resistente dentro de cada especie lo es en todos los medios estudiados.
¿ En general, las diferencias interespecíficas de las cepas más termorresistentes son más marcadas en el medio de pH 7,0 / aw 0,99 y se reducen en los medios de pH 4,0 / aw 0,94. La cepa más termorresistente de las 20 estudiadas en medios de laboratorio es S. Senftenberg 775W, siendo sólo superada por L. monocytogenes en el medio de pH 7,0 y aw 0,94 a baja temperatura. Obviando la cepa S. Senftenberg 775W, el microorganismo más termorresistente es L. monocytogenes, excepto en los medios de pH 4,0, en los cuales S. aureus se muestra más resistente.
¿ En todos los microorganismos se observan condiciones de tratamiento que dan lugar a la aparición de fenómenos de hombro en las gráficas de supervivencia. Estos fenómenos son más relevantes, en frecuencia e importancia relativa, en los dos microorganismos Gram-negativos, y muy especialmente en E. coli. En general, la relación entre la duración del hombro y el valor Dt se mantiene constante a todas las temperaturas de tratamiento, aunque la magnitud de la relación es diferente para cada especie y medio de tratamiento.
¿ Los cambios en el pH y la aw del medio de tratamiento modifican la termorresistencia, aunque la magnitud de su influencia, y las interacciones entre los dos factores dependen del microorganismo estudiado. De acuerdo al modelo desarrollado, los pHs de máxima resistencia son: 5,0, 5,3, 5,8 y 6,0 para S. aureus, E. coli, S. Senftenberg 775W y L. monocytogenes, respectivamente. Este diferente comportamiento determina que S. aureus y E. coli muestren mayor termorresistencia a pH 4,0 que a pH 7,0. En general, el descenso en la aw hasta 0,94 ejerce un efecto protector a todos los pHs, excepto en Salmonella.
¿ En general, el valor z tiende a aumentar con la acidificación y la bajada de la actividad de agua del medio de tratamiento, excepto en L. monocytogenes. Normalmente los cambios del valor z son de escasa cuantía (1°C) con las notables excepciones de Salmonella Senftenberg 775W, que muestra una drástica caída del valor z (3°C) en el medio de pH 7,0 /aw 0,99, y de L. monocytogenes que muestra un drástico aumento (2°C) en ese mismo medio.
¿ El modelo desarrollado, a partir de los datos obtenidos en medios de laboratorio, en ocasiones sobrevalora (en caldos) o infravalora ligeramente (en zumos) la termorresistencia microbiana en matrices alimentarias. Resulta por lo tanto una herramienta útil para describir y comparar el comportamiento de los microorganismos y estudiar las tendencias generales de las interacciones entre los factores, pero su uso para establecer criterios de proceso es arriesgado.
¿ El alimento utilizado afecta notablemente a la termorresistencia de S. Senftenberg y L. monocytogenes, mientras que el efecto en S. aureus y E. coli es de menor magnitud. Las diferencias en termorresistencia entre los cuatro microorganismos son más evidentes en los caldos que en zumo de naranja, especialmente a las temperaturas más elevadas. El microorganismo limitante de los tratamientos térmicos en alimentos sería S. Senftenberg 775W en caldo de pollo y verduras y Escherichia coli O157:H7 en zumo de naranja, en este último caso debido a la presencia de un prolongado fenómeno de hombro, equivalente a hasta 7 veces el valor Dt.
¿ La fracción de células de L. monocytogenes con daños en la membrana citoplasmática aumenta exponencialmente con el tiempo de calentamiento, una vez superada la fase de hombro. La termodependencia de las reacciones que conducen a la muerte celular y al daño subletal es la misma en el zumo de naranja, mientras que en los caldos de pollo y vegetales la termodependencia de la aparición del daño es mayor.
¿ El tratamiento térmico provoca la aparición de especies reactivas del oxígeno en Salmonella Senftenberg, tanto en la cepa termosensible como en la cepa termorresistente 775W. La generación de ROS y el control de la homeostasis redox posterior al tratamiento podrían jugar un papel importante en la inactivación bacteriana por calor.
