Resumen de Esteroles no colesterol en el diagnóstico y tratamiento de las dislipemias primarias
Título de Tesis Esteroles no colesterol en el diagnóstico y tratamiento de las dislipemias primarias.
Justificación Las hiperlipemias primarias son un grupo heterogéneo de enfermedades del trastorno del metabolismo lipídico que se caracterizan por un elevado riesgo cardiovascular. Las formas clínicas más importantes se acompañan de aumentos en la concentración plasmática de colesterol, triglicéridos o de ambos. Aunque la concentración de colesterol y triglicéridos en sangre depende de múltiples mecanismos genéticos y ambientales, los sujetos que presentan fenotipos extremos de hipercolesterolemia o hipertrigliceridemia suelen tener trastornos genéticos como causantes de su enfermedad.
A pesar de los importantes avances en el campo de la genética que han identificado múltiples loci responsables de muchas hiperlipemias, todavía existe un porcentaje muy elevado de dislipemias genéticas de origen desconocido. Básicamente las dislipemias se pueden producir por un aumento intestinal de lípidos, o un aumento de la síntesis hepática por una disminución en su catabolismo o un por una alteración en su eliminación biliar.
El objetivo principal de esta tesis es estudiar el papel de la absorción intestinal y de la síntesis hepática del colesterol en la patogenia de las hiperlipemias hereditarias de las que desconocemos su gen responsable y por tanto su mecanismo de producción.
Del mismo modo, un problema clínico fundamental en las dislipemias es el papel que la dieta juega tanto en su mecanismo de producción como en el efecto beneficioso de los cambios dietéticos. El método tradicional de análisis de la dieta se ha realizado a través de encuestas sobre consumo de alimentos. Sin embargo, este procedimiento tiene muchas limitaciones porque está sujeto a los sesgos que cualquier entrevista clínica lleva asociados y que requieren la colaboración y la subjetividad de los sujetos. El poder identificar patrones metabólicos asociados a la respuesta a la dieta tendría un enorme valor clínico ya que permitiría objetivar y cuantificar el tipo de dieta de los sujetos y el beneficio de una determinada dieta en las distintas dislipemias.
Este trabajo pretende, por tanto, utilizar la cuantificación de esteroles no colesterol en plasma que incluyen fitoesteroles, derivados del colesterol, metabolitos precursores de la síntesis hepática del colesterol y precursores de los ácidos biliares para poder ser utilizados en el diagnóstico de las dislipemias de origen desconocido y en el manejo clínico de los pacientes con dislipemia.
Tradicionalmente la cuantificación de los esteroles no colesterol se ha realizado por cromatografía de gases, un método reservado a la investigación y por lo tanto poco práctico para poder ser utilizado en un número elevado de sujetos, lo que implica su poca utilidad en la práctica clínica. Por eso, este trabajo se propone optimizar un nuevo método que permita la cuantificación sensible, fiable y rápida de los principales esteroles no colesterol, que a su vez permitirían conocer el valor de estos esteroles en el manejo clínico de las dislipemias primarias.
Estructura de la tesis 1. Durante el año 2013-2014 se seleccionaron los sujetos a estudiar y se determinaron las concentraciones de esteroles no colesterol y de colesterol en dichos sujetos por HPLC-MS/MS.
* Se seleccionaron pacientes con hipercolesterolemias primarias de la Unidad Clínica e Investigación en Lípidos y Arteriosclerosis del Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza, España). Los criterios de inclusión fueron: tener más de 18 años de edad y ser diagnosticado de hiperlipemia familiar: hipercolesterolemia familiar (HF) o hiperlipemia familiar combinada (HFC). HF se diagnosticó en sujetos con niveles de cLDL sin tratamiento por encima del perfil 95 según edad y sexo de una población de referencia española, triglicéridos por debajo de 200 mg / dL y transmisión vertical familiar de la hipercolesterolemia con al menos un familiar de primer grado con el cLDL por encima del percentil 95 según edad y sexo, y ausencia de mutaciones funcionales en los genes del LDLR y APOB. El diagnóstico de HFC se basó en la presencia de hiperlipidemia primaria combinada en los pacientes no tratados cuyas concentraciones en suero de colesterol y triglicéridos se encontrasen por encima del percentil 90 para la población española, niveles de apolipoproteína B en suero > 120 mg / dl y tener al menos un familiar de primer grado con hiperlipemia (colesterol total (CT) y / o triglicéridos > percentil 90). Se excluyeron las causas secundarias de hiperlipemia (por ejemplo, índice de masa corporal (IMC) > 30 kg / m2, consumo de alcohol de más de 30 g y 20 g en hombres y mujeres, respectivamente) y sujetos con tratamiento hipolipemiante. También se seleccionó un grupo de sujetos normolipémicos con ningún familiar de primer grado con hiperlipemia para establecer la distribución normal de la población.
* Los esteroles no colesterol y el colesterol de 500 sujetos se determinaron por HPLC-MS/MS. Se determinaron campesterol, sitosterol, estigmasterol, sitostanol, lanosterol, desmosterol, 24S-hidroxicolesterol, 27-hidroxicolesterol y 7α-hidroxicolestestenona mediante la técnica HPLC-MS/MS descrita previamente en Baila-Rueda et al. Los valores obtenidos se expresaron en mg/dL y en ratios colesterol total. Brevemente, se recogieron 100 µl de suero donde se añadió el estándar interno deuterado (2H6) colesterol 26,26,26,27,27,27. Se realizó una hidrólisis alcalina durante 20 min a 60 ºC en un baño de ultrasonidos. La muestra se extrajo dos veces con 3 ml de hexano. El extracto de cargó en un cartucho de extracción en fase sólida (SPE 1mg, Discovery DSC-18, Supelco, España), el cual se acondicionó con 400 µl de metanol y se eluyó por gravedad. Los esteroles no colesterol fueron eluídos con 1,4 µl de 2-propanol por gravedad y 40 µl de la mezcla final fueron inyectados en el sistema HPLC-MS/MS. El mismo proceso fue realizado para la determinación de colesterol en suero con la diferencia de que el estándar interno utilizado en este caso fue el deuterado (2H7) colesterol 26,26,26,27,27,27,27. El equipo de HPLC (Agilent 1200RRLC) usado se acopló a un espectrómetro de masas (Applied Biosystems, Foster City, CA) dotado de un triple cuadrupolo con trampa de iones 4000 QTrap. El espectrómetro de masas tenía la posibilidad de trabajar con un segundo cuadrupolo lo que permitió trabajar en modo de detección multiple reaction monitoring (MRM) produciendo un aumento de la selectividad. Los parámetros que fueron optimizados en los cuadrupolos permitieron que los iones de mayor distribución de masa pasaran a través del cuadrupolo 1 a la celda de colisión, donde los iones son fragmentados y resueltos por el cuadrupolo 3. La fuente de ionización química que posee un gas nebulizador (APCI-heated Nebulizer) y la temperatura de la sonda puede alcanzar hasta 500º C, permitiendo así mejores resultados en la ionización. El equipo posee un detector electromultiplicador de diodos continuos (CEM) que opera en modo de pulsos. La detección de iones se realizó en estado positivo. El valor del ratio señal/ruido de las transiciones se obtuvo por el programa Analyst 1.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
2. Durante el año 2014-2015, se analizaron los datos obtenidos de la determinación de la concentración de esteroles no colesterol frente a colesterol de los 500 sujetos. Análisis estadístico y comparación de los resultados obtenidos mediante el método HPLC-MS/MS frente a los obtenidos por GC (cromatografía de gases). La cuantificación de los esteroles se llevó a cabo con el programa MultiQuant 1.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se cuantifican en cada análisis simultáneamente campesterol, sitosterol, estigmasterol, sitostanol, lanosterol, desmosterol, 24S-hidroxicolesterol, 27-hidroxicolesterol y 7α-hidroxicolestestenona.
3. Durante el año 2015-2016, se ha estudiado las siguientes vías metabólicas del colesterol y elaborado las conclusiones de dicho estudio: 1. Cambios agudos en el contenido de grasa en la dieta modifican la síntesis, la absorción y la eliminación de colesterol.
2. Estos cambios se observaron incluso en la ausencia de cambios CT y cLDL en plasma, demostrando que es posible cuantificar estos cambios en el metabolismo del colesterol analizando los esteroles no colesterol en suero y oxiesteroles por una técnica de alta sensibilidad.
3. El efecto directo de la reducción de la ingesta de grasas afecta directamente a la absorción intestinal de colesterol ya que el colestanol disminuyó en su concreción después de ambas dietas, mayormente después de la ingesta del cordero menos graso.
4. Nuestros resultados indican que los esteroles no colesterol, determinados por un método sensible y cuantitativo, podría utilizarse como marcadores de metabolismo de los lípidos, para supervisar los efectos en la dieta de cambios en AG de una manera precoz y precisa.
5. Hubo una disminución en la producción de ácidos biliares en la vía clásica en la intervención de cordero baja en grasa. Sin embargo, la alternativa o vía ácida mostraron una disminución significativa en ambas intervenciones para 24S-hidroxicolesterol, y en 27- hidroxicolesterol por la intervención de cordero baja en grasa, apoyando la existencia de una vía alternativa de la producción de ácidos biliares por la vía 27-hidroxicolesterol que se modula en la misma dirección que la síntesis de colesterol.
Publicación de artículos * Baila-Rueda L, Perez-Ruiz MR, Jarauta E, Tejedor MT, Mateo-Gallego R, Lamiquiz-Moneo I, De Castro-Oros I, Cenarro A, Civeira F. Cosegregation of serum cholesterol with cholesterol intestinal absorption markers in families with primary hypercholesterolemia without mutations in LDLR, APOB, PCSK9 and APOE genes. Atherosclerosis. 2016;246:202-207.
* Baila-Rueda L, Mateo-Gallego R, Pérez-Calahorra S, Lamiquiz-Moneo I, de Castro-Orós I, Cenarro A, Civeira F. Effect of different fat-enriched meats on non-cholesterol sterols and oxysterols as markers of cholesterol metabolism: results of a randomized and cross-over clinical trial. Journal of Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Disease. 2015;25(9):853-859.
* Baila-Rueda L., Mateo-Gallego R., Acha J., Cenarro A., Civeira F. Severe hypercholesterolemia and phytosterolemia with extensive xanthomas in Primary Biliary Cirrhosis: role of biliary excretion on sterol homeostasis Journal of Clinical Lipidology 2014;8(5):520-524.
* Baila-Rueda L., Mateo-Gallego R., Jarauta E., de Castro-Orós I., Bea A.M., Cenarro A., Civeira F. Bile acid synthesis precursors in Familial combined hyperlipidemia: The oxysterols 24S-hydroxycholesterol and 27-hydroxycholesterol. Biochemical and Biophysical Research Communications 2014;446(3):731-5.
* Baila-Rueda L., Cenarro A., Cofán M., Orera I., Barcelo-Batllori S., Pocoví M., Ros E., Civeira F., Nerín C, Domeño C. Simultaneous determination of oxysterols, phytosterols and cholesterol precursors by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry in human serum. Analytical methods 2013;5(9):2249-2257.
* De Castro-Orós I., Cenarro A., Tejedor T., Baila-Rueda L., Mateo-Gallego R., Lamíquiz-Moneo I., Pocoví M. and Civeira F. Common variants contribute to hypertriglyceridemia without differences between familial combined hyperlipidemia and isolated hypertriglyceridemia Circ Cardiovasc Genet 2014;7(6):814-21 * Mateo-Gallego R., Baila-Rueda L., Mouratidou T., De Castro-Orós I., Bea A.M., Perez-Calahorra S., Cenarro A., Moreno L.A., Civeira F. Serum plant sterols as surrogate markers of dietary compliance in familial dyslipidemias.Clin Nutr. 2014. doi: 10.1016/j.clnu.2014.05.011.
* Jorge I., Burillo E., Mesa R.I., Baila-Rueda L., Moreno M., Trevisan-Herraz M., Silla-Castro J.C., Camafeita E., Ortega-Muñoz M., Bonzon-Kulichenko E., Calvo I., Cenarro A., Civeira F., Vázquez J. The human HDL proteome displays high inter-individual variability and is altered dynamically in response to angioplasty-induced atheroma plaque rupture. J Proteomics 2014;106:61-73 * Mateo-Gallego R., Perez-Calahorra S., Cofán M., Baila-Rueda L., Cenarro A., Ros E., Puzo J., Civeira F. Serum lipid responses to weight loss differ between overweight adults with familial hypercholesterolemia and those with familial combined hyperlipidemia. J Nutr. 2014 Aug;144(8):1219-26 * Jarauta E., Mateo-Gallego R., Bea A.M., Crespo M., Balllester A., Rubio M.V., Baila-Rueda L., Carmarza P., Cenarro A., de Groot E., Civeira F. Atherosclerosis progression in patients with autosomal dominant hypercholesterolemia in clinical practice. J Clin Lipidol. 2014;8(4):373-80.
* Burillo E., Martín-Fuentes P., Mateo-Gallego R., Baila-Rueda L., Cenarro A., Ros E., Civeira F. Omega-3 fatty acids and HDL. How do they work in the prevention of cardiovascular disease? Current Vascular Pharmacology 2012; 10(4):432-41.
* Civeira F., Baila-Rueda L., De Castro-Orós I., Mateo-Gallego R. and Ana Cenarro. Novedades en el metabolismo lipídico. Nefrología Sup Ext 2013; 4(4):9-17.
* Civeira F., Pérez-Ruiz M.R., Baila-Rueda L. Síndrome metabólico: concepto, epidemiología, etiopatogenia y complicaciones. Medicine 2013; 11(40):2402-2409.
