Desarrollo y puesta a punto de la técnica de liofilización espermática como método de preservación de material genético
- Autores: Maite Olaciregui Rodriguez
- Directores de la Tesis: Lydia Gil Huerta (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Emilio Martínez Garcia (presid.), Clara María Malo Ladrero (secret.), Carlos Carmelo Pérez Marín (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La liofilización espermática, se ha establecido como método alternativo para conservar dosis seminales en las distintas especies animales. Muchos factores influyen en el proceso de liofilización provocando daños de diferente naturaleza en los espermatozoides. El principal objetivo de este trabajo fue investigar estrategias para controlar esos factores con el fin de mantener la integridad del ADN y la funcionalidad de los espermatozoides liofilizados. Para ello, valoramos sustancias que añadidas al diluyente de liofilización nos permitan minimizar el daño en el ADN: EGTA, EDTA, ácido rosmarínico y trehalosa. También valoramos el efecto de la temperatura y tiempo de almacenamiento sobre la integridad del ADN de los espermatozoides liofilizados. Y finalmente comprobamos la efectividad de todos los factores estudiados en la fertilización in vitro utilizando la inyección intracitoplasmática para obtener embriones a partir de espermatozoides liofilizados.
En la primera experiencia se evaluó la integridad del ADN de espermatozoides caninos liofilizados con dos tipos de agentes quelantes: EDTA Y EGTA, combinados con dos tipos de agentes protectores: ácido rosmarínico y trehalosa, y almacenados a dos temperaturas distintas: 4 ⁰C y temperatura ambiente. En las muestras liofilizadas con EGTA Y EDTA sin suplementación, también se llevó a cabo un análisis comparativo de las distintas poblaciones espermáticas presentes en dichas muestras tras un mes y 5 meses de almacenamiento a 4 ⁰C y a temperatura ambiente. Las muestras seminales obtenidas a partir de cuatro machos de dos años de edad de raza Beagle, se liofilizaron en ocho medios de liofilización distintos: EGTA (10 mM Tris–HCl buffer + 50 mM NaCl + 50 mM EGTA); EGTAR (EGTA + 105 µM ácido rosmarínico) EGTAT (EGTA + 0,2M trehalosa); EGTART (EGTA+ 105 µM ácido rosmarínico + 0,2M trehalosa); EDTA (10 mM Tris–HCl buffer + 50 mM NaCl + 50 mM EDTA); EDTAR (EDTA + 105 µM ácido rosmarínico); EDTAT (EDTA + 0,2M trehalosa); EDTART (EGTA+ 105 µM ácido rosmarínico + 0,2M trehalosa). Una vez liofilizadas las muestras se almacenaron a 4 ⁰C y a temperatura ambiente, y el análisis de la integridad del ADN se realizó tras 1 mes, 5 meses y 1 año de almacenamiento mediante el test de dispersión de la cromatina (SCDt, Halomax®). En el estudio comparativo de poblaciones, encontramos cuatro poblaciones espermáticas distintas en función a el tamaño del halo alrededor de la cabeza de los espermatozoides: (1) ausencia de halo, (2) halo <6 µm, (3) halo 6–10 µm y (4) halo >10 µm, que representarían espermatozoides con distinto grados de daño en el ADN nuclear. El porcentaje más alto (14,7%) de espermatozoides con halo > 10 µm se obtuvo cuando las muestras fueron liofilizadas en el medio EDTA y almacenadas a temperatura ambiente durante 5 meses, mientras que el más bajo (<1%) cuando se almacenaron durante 1 mes. El nivel de fragmentación de ADN espermático fue significativamente menor en muestras liofilizadas con EGTA que en aquellas liofilizadas con EDTA.
Independientemente del tipo de agente quelante usado, las muestras liofilizadas en medio suplementado con ácido rosmarínico o con trehalosa, mostraron un porcentaje de espermatozoides con daño en el ADN significativamente menor que aquellas liofilizadas sin suplementación en el medio. En cuanto a la influencia de las condiciones de almacenamiento los resultados mostraron un efecto negativo del tiempo y un efecto positivo de la temperatura ambiente sobre la integridad del ADN espermático.
El objetivo de la segunda experiencia fue comparar el efecto protector de los agentes quelantes EDTA y EGTA sobre la integridad del ADN de los espermatozoides equinos liofilizados utilizando tres técnicas de análisis de ADN. Las muestras seminales obtenidas a partir de dosis comerciales de machos de fertilidad probada se liofilizaron en el medio de liofilización básico (10 mM Tris–HCl buffer + 50 mM NaCl) suplementado con 50 mM EGTA o con 50 mM EDTA. Los viales de las muestras espermáticas liofilizadas se almacenaron durante 1 año a 4 ⁰C. Tras la rehidratación de las muestras liofilizadas, se llevó a cabo el análisis de la integridad del ADN utilizando tres técnicas distintas de forma simultánea: Test de dispersión de la cromatina (SCDt, Halomax®), test de naranja de acridina (AOT) y tinción Diff-Quick (DQ). Utilizando cualquiera de las tres técnicas, el nivel de fragmentación de ADN espermático fue significativamente menor en las muestras liofilizadas con EGTA que en aquellas liofilizadas con EDTA. En cuanto a las técnicas de evaluación de ADN la AOT detecto una proporción significativamente mayor de espermatozoides con el ADN fragmentado que la DQ y SCDt. Se encontró correlación positiva entre las técnicas SCD Y DQ mientras que entre ambas y la AOT se detectó una correlación negativa. Lo que sugiere que tanto el test de dispersión de la cromatina como la tinción Diff-Quick son métodos efectivos para detectar la fragmentación del ADN de espermatozoides equinos liofilizados, mientras que el uso de la naranja de acridina resulta menos sensible.
En la tercera experiencia valoramos el efecto de la combinación de EGTA con ácido rosmarínico así como de la temperatura de almacenamiento sobre la integridad del ADN de espermatozoides ovinos liofilizados. Además, evaluamos la capacidad de desarrollo embrionario de los ovocitos inyectados con espermatozoides ovinos liofilizados. Las muestras seminales obtenidas a partir de tres moruecos de raza Rasa Aragonesa se liofilizaron con el medio compuesto por 10 mM Tris–HCl buffer + 50 mM NaCl + 50 mM EGTA, y con este medio suplementado con 105 µM de ácido rosmarínico. Las muestras se almacenaron durante un año a dos temperaturas distintas: 4 ⁰C y temperatura ambiente. Tras la rehidratación se llevó a cabo el análisis de la integridad del ADN utilizando el test de dispersión de la cromatina (SCDt, Halomax®). Además, comprobamos la capacidad de los espermatozoides de ovino liofilizados para fecundar ovocitos mediante inyecciones intracitoplasmáticas. Para ello ovocitos madurados in vitro fueron microinyectados, mediante ICSI, con espermatozoides liofilizados/rehidratados y con congelados/descongelados como control. Tras el cultivo embrionario se valoró la formación de pronúcleos, la tasa de clivaje y el porcentaje de embriones obtenidos con cada grupo experimental. Independientemente de la temperatura de almacenamiento, cuando se añade ácido rosmarínico al medio de liofilización el porcentaje de espermatozoides con daño en el ADN disminuye significativamente. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre las temperaturas de almacenamiento estudiadas. En cuanto al desarrollo embrionario tras la ICSI, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos estudiados en términos de estadio nuclear, clivaje y producción de embriones. El porcentaje de desarrollo embrionario fue similar entre los grupos de ovocitos inyectados con semen liofilizado y el grupo control inyectado con semen congelado/descongelado.
En la cuarta experiencia se evaluó el efecto de la combinación de dos tipos de agentes quelantes: EGTA y EDTA con ácido rosmarínico sobre la integridad del ADN de espermatozoides porcinos liofilizados así como sobre el desarrollo embrionario in vitro de ovocitos microinyectados con esos espermatozoides. Las muestras seminales obtenidas a partir de dosis comerciales de machos de fertilidad probada, se liofilizaron en el medio de liofilización básico (10 mM Tris–HCl buffer + 50 mM NaCl) suplementado con 50 mM EGTA o con 50 mM EDTA, y con esos medios suplementados con 105 µM de ácido rosmarínico. Los viales de las muestras espermáticas liofilizadas se almacenaron durante 1 año a 4 ⁰C. Tras la rehidratación se llevó a cabo el análisis de la integridad del ADN utilizando el test de dispersión de la cromatina (SCDt, Halomax®). Además, a partir de muestras liofilizadas comprobamos la capacidad de los espermatozoides para inducir desarrollo embrionario. Para ello ovocitos madurados in vitro fueron microinyectados, mediante ICSI, con espermatozoides liofilizados/rehidratados y con congelados/descongelados como control. Tras el cultivo embrionario se valoró la formación de pronúcleos, la tasa de clivaje y la tasa de desarrollo embrionario obtenidos con cada grupo experimental.
La presencia de EDTA en el medio de liofilización preservó más eficientemente la integridad del ADN de los espermatozoides porcinos que la presencia de EGTA. Cuando se añadió ácido rosmarínico al medio de liofilización, el porcentaje de espermatozoides con el ADN fragmentado disminuyó significativamente. No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos con suplementación de ácido rosmarínico (EDTAR y EGTAR), ni entre estos y el control. Cuando el semen liofilizado fue utilizado para la inyección intracitoplasmática, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos estudiados, tanto entre los liofilizados como entre estos y el control congelado, en términos de estadio nuclear y desarrollo embrionario.
