Hemoglobinas y óxido nítrico en plantas
- Autores: Laura María Calvo Beguería
- Directores de la Tesis: Manuel Becana Ausejo (dir. tes.), Maria del Carmen Rubio (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María F. Fillat (presid.), Estibaliz Larrainzar Rodriguez (secret.), Pedro María Aparicio Tejo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Zaragoza
- Materias:
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- Resumen
MEMORIA DEL PROYECTO DE TESIS DOCTORAL A. Título de la tesis Hemoglobinas y óxido nítrico en plantas B. Estado de la cuestión Las leguminosas desempeñan un papel importante en la agricultura debido a su valor como fuente de proteínas vegetales para la alimentación humana y animal. Además, la fijación de nitrógeno atmosférico que realizan las leguminosas en simbiosis con los rizobios del suelo supone un ahorro energético en fertilización y reduce el uso de fertilizantes nitrogenados que contaminan el medioambiente. La fijación biológica de nitrógeno tiene lugar en los nódulos de las raíces de las leguminosas mediante el complejo enzimático nitrogenasa (Beijerinck, 1901). Los nódulos se forman por la interacción simbiótica de la raíz de las leguminosas con bacterias del suelo denominadas rizobios. La leghemoglobina (Lb) es una proteína esencial para el transporte y regulación de la concentración de oxígeno en las células de los nódulos (Becana y cols, 1995). La Lb se encuentra exclusivamente en los nódulos, a concentraciones de 1-2 mM (Gupta y cols, 2011). Sin embargo, hay otras hemoglobinas (Hbs) que se expresan no sólo en los nódulos sino también en semillas, hojas, raíces, flores y frutos. Estas Hbs se agrupan en tres clases atendiendo a su filogenia y propiedades bioquímicas. Las Hbs de clase 1 y 2 se denominan también "no simbióticas" y las Hbs de clase 3 se conocen como "truncadas".
La función de las Hbs no simbióticas y truncadas es poco conocida. Se sabe que al menos una función de las Hbs de clase 1, que tienen una afinidad extremadamente alta por el oxígeno (Hargrove y cols, 2000) y se inducen a bajas temperaturas y en hipoxia (Shimoda y cols, 2005), es controlar la concentración de óxido nítrico (NO) (Igamberdiev y Hill, 2004; Hebelstrup y cols, 2013). Las Hbs de clase 2 se consideran precursoras de las Lbs, además se inducen por frío y citoquininas (Hunt y cols, 2001). Asimismo, existen evidencias que indican un posible papel de las Hbs de clase 2 en tejidos jóvenes y en desarrollo (Vigeolas y cols, 2011) e incluso un papel protector frente a estrés oxidativo y nitrosativo (Sainz y cols, 2013); sin embargo, debido a sus características de afinidad por O2, no se descarta una función relacionada con el transporte, almacenamiento o percepción de O2 (Kakar y cols, 2010). Las Hbs de clase 3 presentan una baja afinidad por O2 y su expresión disminuye en condiciones de hipoxia (Watt y cols, 2001), y su función podría estar relacionada con el secuestro de NO durante la simbiosis, suprimiendo la respuesta defensiva de la planta (Vieweg y cols, 2005). Las Hbs se localizan en el núcleo y citosol de las células de las hojas y raíz (Seregélyes y cols, 2000; Qu y cols, 2005; Hebelstrup y cols, 2008; Sainz y cols, 2013).
En esta Tesis, nos propusimos conocer más acerca de la estructura, localización y función de las tres clases de Hbs de leguminosas, y especialmente respecto de la capacidad de las proteínas para interaccionar con el NO. En este contexto, realizamos un estudio detallado de la producción y localización de NO en nódulos de leguminosas.
C. Objetivos y metodología Los objetivos de la tesis fueron los siguientes: 1. Caracterizar las cinco Hbs no simbióticas (clase 1 y 2) y truncadas (clase 3) de Lotus. Este estudio incluirá la determinación de las cinéticas del hemo al ligando modelo CO, la contribución de las Cys a la estabilidad de las proteínas y la capacidad de las Hbs para ser nitrosiladas en el hemo y en los residuos de Cys.
2. Localizar a nivel subcelular las cinco Hbs mediante inmunomarcado y fusiones LjGlb-GFP en distintos sistemas de expresión y con dos plantas modelo (Arabidopsis thaliana y Nicotiana benthamiana).
3. Determinar la función de las Hbs no simbióticas considerando su localización subcelular. En particular, se estudiará el papel de las LjGlbs en la señalización y secuestro de NO mediante nitrosilación. Además, se investigará la posible participación de las Hbs en la regulación por ácido abscísico, una hormona que induce la producción de NO.
4. Fenotipar líneas mutantes por inserción del retrotransposón LORE1 en los genes que codifican las Hbs de Lotus. Se determinarán parámetros de crecimiento de las plantas hasta la etapa de fructificación, incluyendo en el fenotipado el proceso de nodulación.
5. Estudiar la localización y producción de NO durante la senescencia natural (envejecimiento) e inducida por NO3¯ en nódulos de judía y soja. Se compararán metodologías que utilizan nódulos intactos (EPR) y nódulos seccionados (sonda fluorescente y microscopía confocal).
El desarrollo de estos objetivos requiere el empleo de gran diversidad de técnicas, entre las que se encuentran: -expresión y purificación de Hbs: cromatografía de afinidad a metal, intercambio aniónico y exclusión molecular -análisis por fotólisis con flash de láser y espectroscopía de flujo detenido, así como la determinación de la actividad óxido nítrico dioxigenasa (NOD) mediante el uso de un electrodo selectivo de NO.
-análisis de la expresión génica mediante qRT-PCR -cultivo de plantas y bacterias -microscopía confocal y de fluorescencia -electroforesis desnaturalizante y nativa de proteínas, western blot -espectroscopía UV-visible D. Conclusiones y resultados más destacados 1. La leguminosa modelo Lotus japonicus expresa cinco Hbs no simbióticas (clases 1 y 2) y truncadas (clase 3). Las Hbs de clase 1 (LjGlb-1 y LjGlb1-2) son hexacoordinadas, la de clase 2 (LjGlb2) es pentacoordinada en ausencia de ligando y las de clase 3 (LjGlb3-1 y LjGlb3-2) son pentacoordinadas. LjGlb3-2 forma homodímeros mediante enlaces disulfuro, al igual que LjGlb1-1. Las tres clases de Hbs presentan diferentes afinidades por el CO (ligando modelo), que se corresponden con las O2 y que están determinadas por las constantes de disociación. Las afinidades de las Hbs de clase 1, 2 y 3 son altas, moderadas y bajas, respectivamente.
2. Nuestros estudios con las Hbs de Lotus japonicus y Arabidopsis thaliana indican que los residuos de Cys son importantes para la estabilidad y función de las proteínas, y que pueden nitrosilarse in vitro e in vivo. La nitrosilación podría tener una función señalizadora y transportadora de NO, pero no interviene en el secuestro de NO, que es atribuible al grupo hemo a través de la actividad NOD.
3. Combinando técnicas de inmunomarcado y etiquetado de proteínas con GFP en varios sistemas de expresión, hemos localizado las cinco Hbs en el núcleo y citoplasma de las células de los nódulos y hojas, en los plastidios de los nódulos y en los cloroplastos de las hojas, a excepción de LjGlb3-2, que sólo se detecta en el núcleo y citosol. Esta es la primera demostración de que existen Hbs en los cloroplastos, a pesar de que las proteínas carecen de un péptido señal cloroplástico.
4. En los cloroplastos de las células guarda de los estomas, las Hbs participan en la regulación de los niveles de NO mediante su actividad NOD, lo que requiere un mecanismo de regeneración de la oxiferro-Hb a partir de la ferri-Hb para mantener la actividad NOD. Además, las Hbs podrían afectar la expresión de los genes de respuesta a ABA.
5. El uso de mutantes LORE1 mostró que LjGlb1-1 es importante para la nodulación, ya que su deficiencia produce una disminución de los cordones de infección debido a la acumulación transitoria de NO en las raíces infectadas. Esta proteína es capaz de regular los niveles de NO durante la simbiosis. Los mutantes LjGlb1-2 están afectados en el crecimiento y, aunque su deficiencia reduce el número de nódulos, la proteína no parece estar implicada en la nodulación. Por otra parte, los mutantes LjGlb2 crecen menos y producen menos semillas, mientras que los mutantes LjGlb3-2 presentan una disminución de los cordones de infección y del número de nódulos.
6. Los nódulos de judía son más sensibles al nitrato que los de soja. Los nódulos de judía no contienen prácticamente nitrito debido a que sus bacteroides no expresan NR, mientras que los nódulos de soja pueden acumular nitrito debido a una elevada actividad NR en los bacteroides y en la planta. Sin embargo, detectamos nitración de Lb tanto en nódulos jóvenes como senescentes de ambas especies, lo que demuestra la producción de NO independiente de nitrato y sugiere que la formación de Lb nitrada es fisiológica.
7. Los estudios de EPR demuestran que en condiciones fisiológicas no se genera LbNO. Este complejo sólo se genera en nódulos formados por cepas de rizobio mutantes (deficientes en NiR o NOR) o como un artefacto tras la escisión de los nódulos si no se detiene inmediatamente su metabolismo. Por tanto, el EPR es el método idóneo para detectar NO en nódulos intactos recién extraídos de la raíz. Además, nuestros resultados indican que los bacteroides son la principal fuente de NO en los nódulos.
8. Se ha detectado NO en la zona infectada de nódulos de judía y soja, así como en el córtex interno de nódulos de soja. La detección de NO en nódulos sin nitrato demuestra la existencia de una fuente adicional de NO independiente de la NR de la planta, probablemente una enzima tipo NO sintasa. La comparación de las técnicas de EPR y fluorimétrica permite concluir que el NO observado en secciones de nódulos mediante microscopía confocal representa el NO que puede generarse potencialmente en cada tejido de los nódulos (córtex interno y zona infectada). Por tanto, los resultados de NO obtenidos con una sonda fluorescente sólo deben ser utilizados con fines comparativos y nunca cuantitativos.
E. Bibliografía Becana M, Moran JF, Iturbe-Ormaetxe I, Gogorcena Y, Escuredo PR (1995) Structure and function of leghemoglobin. Annal Estac Exp Aula Dei 21: 203-208 Beijerinck M (1901) Über oligonitrophile Mikroben. Centralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene 7: 561-582 Gupta KJ, Hebelstrup KH, Mur LA, Igamberdiev AU (2011) Plant hemoglobins: important players at the crossroads between oxygen and nitric oxide. FEBS Lett 585: 3843-3849 Hargrove MS, Brucker EA, Stec B, Sarath G, Arredondo-Peter R, Klucas RV, Olson JS, Phillips GN (2000) Crystal structure of a nonsymbiotic plant hemoglobin. Structure 8: 1005-1014 Hebelstrup KH, Østergaard-Jensen E, Hill RD (2008) Bioimaging techniques for subcellular localization of plant hemoglobins and measurement of hemoglobin-dependent nitric oxide scavenging in planta. Methods Enzymol 437: 595-604 Hebelstrup KH, Shah JK, Igamberdiev AU (2013) The role of nitric oxide and hemoglobin in plant development and morphogenesis. Physiol Plant 148: 457-469 Hunt PW, Watts RA, Trevaskis B, Llewelyn DJ, Burnell J, Dennis ES, Peacock WJ (2001). Expression and evolution of functionally distinct haemoglobin genes in plants. Plant Mol Biol 47: 677-92 Hunt PW, Klok EJ, Trevaskis B, Watts RA, Ellis MH, Peacock WJ, Dennis ES (2002) Increased level of hemoglobin 1 enhances survival of hypoxic stress and promotes early growth in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 99: 17197-17202 Igamberdiev AU, Hill RD (2004) Nitrate, NO and haemoglobin in plant adaptation to hypoxia: an alternative to classic fermentation pathways. J Exp Bot 55: 2473-2482 Kakar S, Hoffman FG, Storz JF, Fabian M, Hargrove MS (2010) Structure and reactivity of hexacoordinate hemoglobins. Biophys Chem 152: 1-14 Qu ZL, Wang HY, Xia GX (2005) GhHb1: a nonsymbiotic hemoglobin gene of cotton responsive to infection by Verticillium dahliae. Biochim Biophys Acta 1730: 103-113 Sainz M, Calvo-Begueria L, Pérez-Rontomé C, Wienkoop S, Abián J, Staudinger C, Bartesaghi S, Radi R, Becana M (2015) Leghemoglobin is nitrated in functional legume nodules in a tyrosine residue within the heme cavity by a nitrite/peroxide-dependent mechanism. Plant J 81: 723-735 Shimoda Y, Nagata M, Suzuki A, Abe M, Sato S, Kato T, Tabata S, Higashi S, Uchiumi T (2005) Symbiotic rhizobium and nitric oxide induce gene expression of non-symbiotic hemoglobin in Lotus japonicus. Plant Cell Physiol 46: 99-107 Seregélyes C, Mustárdy L, Ayaydin F, Sass L, Kovács L, Endre G, Lukács N, Kovács I, Vass I, Kiss GB, Horváth GV, Dudits D (2000) Nuclear localization of a hypoxia-inducible novel non-symbiotic hemoglobin in cultured alfalfa cells. FEBS Lett 482: 125-130 Vieweg MF, Hohnjec N, Küster H (2005) Two genes encoding different truncated hemoglobins are regulated during root nodule and arbuscular mycorrhiza symbioses of Medicago truncatula. Planta 220: 757-766 Vigeolas H, Hühn D, Geigenberger P (2011) Nonsymbiotic hemoglobin-2 leads to an elevated energy state and to a combined increase in polyunsaturated fatty acids and total oil content when overexpressed in developing seeds of transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol 155: 1435-1444 Watts RA, Hunt PW, Hvitved AN, Hargrove MS, Peacock WJ, Dennis ES (2001) A hemoglobin from plants homologous to truncated hemoglobins of microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA 98: 10119-10124
