Bioseguridad de la terapia génica cutánea: estudio de genotoxicidad en vectores lentivirales autoinactivantes y desarrollo de estrategias para la corrección clonal de la epidermolisis bullosa distrófica por recombinación homóloga
- Autores: David Almarza Gómez
- Directores de la Tesis: Fernando Larcher Laguzzi (dir. tes.), Rodolfo Murillas Angoiti (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Manuel Bautista Santa Cruz (presid.), Antonio Liras Martín (secret.), José Carlos Segovia Sanz (voc.), Guillermo Güenechea Amurrio (voc.), Manuel Ramírez Orellana (voc.)
- Materias:
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- Resumen
En este trabajo de tesis hemos estudiado la bioseguridad de la terapia génica cutánea mediante análisis de riesgos genotóxicos derivados del uso de vectores gamma-retrovirales y lentivirales autoinactivantes y el desarrollo de estrategias para la cor rección de la Epidermolisis Bullosa Distrófica (EBD) basadas en la recombinación homóloga.
La principal forma de mutagénesis asociada a los vectores gamma-retrovirales y lentivirales usados en terapia génica es la transactivación génica a larga dista ncia por la interacción del enhancer vírico con promotores de genes celulares. Otro mecanismo potencial de mutagénesis asociado a este tipo de vectores y que no está tan estudiado es el read-through transcripcional. Este mecanismo ocurre cuando la tr anscripción del genoma del vector en su forma proviral no termina en la señal de poliadenilación propia del vector y continúa en el genoma de la célula huésped. En esta tesis se ha estudiado por primera vez el read-through transcripcional de un vecto r lentiviral autoinactivante, a partir de su forma proviral en clones de queratinocitos (de la línea celular HaCaT) escogidos de forma aleatoria. Los resultados del estudio por Northern blot evidencian una frecuencia relativamente alta en la formació n de transcriptos de fusión entre el genoma del vector y el genoma de la célula. Por otro lado, el análisis de la estructura de estos transcriptos aberrantes por 3¿ RACE-PCR y RT-PCR muestra dos tipos de transcriptos quiméricos: 1) transcriptos de fu sión no procesados entre el genoma proviral y regiones intergénicas o intrónicas del genoma de la célula, y 2) transcriptos de fusión con regiones codificantes del genoma celular, y por ello con mayor potencial mutagénico, procesados en su mayoría d esde un sitio críptico de donación de splicng situado en la secuencia dNEF del vector a sitios de acepción de splicing de genes localizados en los sitios de integración del vector. También se demuestra en esta tesis que el segundo tipo de transcripto s son degradados por el mecanismo celular NMD (Non Sense Mediated Decay). Sin embargo, la deleción del sitio críptico de donación de splicing en dNEF dio lugar a la formación de un transcripto quimérico procesado desde un sitio críptico de donación d e splicing situado antes del codón de stop del transgén, el cual evadía el mecanismo de regulación NMD.
Además de los problemas de bioseguridad derivados del uso de vectores gamma-retrovirales y lentivirales, la aplicación de estos para la correcci
