Resumen de Efecto de las plaquetas en la expresión proteica de segmentos de aorta sana y preinflamada: un abordaje proteómico
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Actualmente poseemos un amplio conocimiento de los efectos que ejerce la pared vascular sobre las plaquetas, pero son muy escasos y limitados los estudios que examinan el efecto contrario, el de las plaquetas sobre la expresión proteica de la pared vascular. Las plaquetas son fuente de numerosos mediadores, incluyendo factores de crecimiento y otras sustancias que pueden influir en la expresión de proteínas de la pared vascular. En este sentido, estudios in vitro han sugerido que las plaquetas pueden modular la expresión de proteínas asociadas al proceso inflamatorio.
El en presente estudio se analizó si las plaquetas pueden modificar la expresión proteica en la pared vascular. Se utilizaron modelos de coincubación in vitro de plasma rico en plaquetas (PRP) con controles y con segmentos de aorta bovina preincubados con 10 ng.ml de TNF-alfa. En los experimentos de coincubación se utilizaron dos concentraciones diferentes de plaquetas (105 y 107 plaquetas.pocillo). Estos sistemas de coincubación se prepararon utilizando membranas estériles de tipo Transwell-COL(Corning incorporated) con poros de 0.4 mm, que contenían las plaquetas dentro de los pocillos donde estaban emplazados con segmentos de aorta bovina. Se utilizó la electroforesis bidimensional, la espectrometría de masas y la técnica western blot para analizar los cambios en la expresión proteica asociados con el citoesqueleto y el metabolismo energético en los segmentos de aorta. Se determinó la actividad enzimática en la pared vascular siguiendo el método descrito por Misset y Opperdoes. También se cuantificó el contenido de piruvato en las muestras de aorta bovina.
En la pared vascular normal disminuyó la expresión de diferentes proteínas relacionadas con el citoesqueleto al coincubar los segmentos de aorta con PRP. Sin embargo, cuando el PRP fue incubado con los segmentos preestimulados con TNF-alfa se modificó un menor número de las proteínas de este sistema. Con respecto al metabolismo energético, en los segmentos controles el PRP no modificó ninguna de las proteínas. Sin embargo, en los segmentos preestimulados la presencia de PRP sobreexpresó la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Además, mediante western blot, se observó que en los segmentos preincubados con TNF-alfa había una disminución de la expresión de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa. No se observaron diferencias en la expresión de la triosa fosfato isomerasa ni en la cadena alfa de la ATP sintasa. Adicionalmente, se observó una disminución significativa de la actividad de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa y del contenido de piruvato sin modificación de la actividad de la triosa fosfato isomerasa.
El principal hallazgo de esta tesis fue que en la pared vascular normal las plaquetas pueden modificar la expresión de proteínas asociadas con el sistema contráctil y con el metabolismo energético por sí mismas. Sin embargo, bajo una situación inflamatoria las plaquetas cambian la expresión de un menor número de proteínas asociadas con estos dos sistemas previamente mencionados. La interacción entre las plaquetas y la pared vascular es bidireccional y las plaquetas pueden regular en la pared vascular la expresión de proteínas asociadas con el citoesqueleto y el metabolismo energético, particularmente en la pared vascular normal.
- English
Although much is known about the effects of the vascular wall on platelets, studies examining the effect of platelets on the expression of proteins in the vascular wall are sparse. MATERIALS AND METHODS. We used an in vitro model coincubating human platelet rich plasma (PRP) with control and TNF-#xF061;-preincubated bovine aortic segments. Two different platelet concentrations (105 and 107 platelets/well) were used. The coincubation system was prepared by placing sterile Transwell-COL(Corning incorporated) inserts, containing the platelets, into wells containing the bovine aortic segments. 2-DE, MS and western blot analysis were used to determine changes in the expression of proteins associated with the cytoskeleton and energetic metabolism in the aortic segments. The enzymatic activity was determined and the content of pyruvate was also quantified. RESULTS. In control healthy vascular wall, only the cytoskeleton-related proteins expression was modified by PRP. However, when PRP was coincubated with TNF-#xF061; pre-stimulated aortic segments lesser number of cytoskeleton-related proteins were modified. With respect to energetic metabolism, in control segments PRP failed to modify any of the analyzed energetic-related proteins. However, in TNF-#xF061;-preincubated segments the presence of PRP upexpressed glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase. Moreover, by western blot experiments it was observed that in TNF-#xF061;-preincubated segments the expression of fructose 1,6-bisphosphate aldolase was downregulated by platelets. In addition, the activity of fructose 1,6-bisphosphate aldolase and piruvate content was reduced without modification on triosephosphate isomerase activity. CONCLUSIONS. In the control vascular wall platelets by themselves affected the expression of a number of proteins associated with contractile system and the energetic metabolism. However, under vascular pre-inflammatory state, platelets modified the expression of a lesser number of proteins associated with contractile system and energetic metabolism.
