Resumen de Caracterización de proteínas con actividad antifúngica producidas por Penicillyum chrysogenum
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Las condiciones ambientales en que se procesan o se almacenan diversos tipos de alimentos favorecen el desarrollo en su superficie de mohos que tienen la capacidad de adaptarse y desarrollarse en sustratos muy diversos. En productos cárnicos madurados y quesos es frecuente el desarrollo una población fúngica superficial que puede tener efectos deseables, ya que contribuyen en gran medida a la formación del sabor, aroma o textura del producto acabado. Pero el desarrollo de mohos no siempre es deseable en alimentos.
Muchos mohos son alterantes, llevando al deterioro de las características sensoriales de los alimentos. No obstante, el aspecto más preocupante respecto del desarrollo de una población fúngica en alimentos es su capacidad para producir micotoxinas.
Existen numerosos mecanismos para controlar el desarrollo microbiano en distintos tipos de alimentos, incluyendo métodos físicos y químicos. Estos tratamientos resultan eficaces para evitar el desarrollo de mohos en determinados alimentos, pero no son adecuados para otros productos como los madurados, donde la presencia de ciertos mohos es beneficiosa y además la aplicación de fungicidas está limitada. Una posible solución en este tipo de alimentos sería el empleo de proteínas antifúngicas que evitaran el desarrollo de mohos indeseables y que a la vez permitieran el crecimiento de mohos beneficiosos en los productos madurados.
En estudios previos se seleccionaron dos cepas no toxigénicas de P. chrysogenum, RP42C y AS51D, procedentes de jamón curado, por su capacidad para inhibir el desarrollo de mohos toxigénicos frecuentes en alimentos. Además, se purificaron dos proteínas con actividad antifúngica, PgAFP y PgChP a partir de RP42C y AS51D, respectivamente.
El objetivo fundamental de este trabajo ha sido la caracterización de las dos proteínas PgAFP y PgChP. Esta caracterización se ha basado en: la determinación de sus secuencias aminoacídicas, la obtención de las secuencias de los genes que las codifican; la evaluación preliminar de su toxicidad; el estudio de la influencia de diversos tratamientos sobre la estabilidad de las proteínas y el efecto sobre la actividad antifúngica de compuestos comúnmente encontrados en alimentos.
Pese a que tanto PgAFP como PgChP son proteínas con efecto antifúngico, han resultado ser muy diferentes en cuanto a sus pesos moleculares, puntos isoeléctricos y secuencias aminoacídicas. PgAFP tiene un peso molecular de 6,5 kDa, un punto isoeléctrico determinado previamente de 9,2, y no posee glicosilaciones pese a que estudios preliminares apuntaban a que presentaba esta modificación. Este hecho se confirmó con la obtención de la secuencia del gen que codifica la proteína y la consiguiente determinación de la secuencia aminoacídica deducida. PgChP sin embargo, mostró tener seis isoformas glicosiladas con pesos moleculares comprendidos entre 30 y 31 kDa, separados por una masa de 162 Da que podría corresponder a un residuo de manosa o galactosa. Además, la secuencia deducida del gen permitió encontrar dos posibles sitios de glicosilación (Asn-Phe-Thr y Asn-Asp-Cys) y la presencia de cadenas glucídicas se demostró mediante deglicosilaciones enzimáticas. PgChP además presentó un punto isoeléctrico cercano a 5, por lo que la proteína no es catiónica.
Las secuencias obtenidas de los genes pgafp y pgchp que codifican PgAFP y PgChP tuvieron un tamaño de 276 y 912 pb, que codifican 92 y 304 aminoácidos, respectivamente. Además, estos genes presentaron varios intrones pequeños con marcadores típicos de intrones fúngicos.
La obtención de las secuencias aminoacídicas permitió encontrar proteínas con cierta similitud en su estructura primaria. Así, PgAFP presentó un 79% de homología con la proteína Anafp de A. niger y PgChP resultó tener cerca del 60% de similitud con la familia de hidrolasas GH-75 compuesta por quitosanasas principalmente fúngicas. Tanto PgAFP como PgChP presentan en su secuencia aminoacídica deducida una parte que corresponde a un péptido señal necesario para que ambas proteínas sean secretadas al medio extracelular. Además PgAFP, al igual que Anafp y otras proteínas con estructura primaria parecida, presenta una prosecuencia, que parece mantener la proteína inactiva para no causar daño a su moho productor, hasta que este fragmento es eliminado durante su secreción.
La actividad antifúngica de PgAFP y de PgChP se inhibe por altas concentraciones (100 mM) de ciertos cationes, especialmente los divalentes Ca2+ y Mg2+. Al igual que lo propuesto para otras proteínas como las defensinas, el mecanismo de acción de PgChP y PgAFP podría basarse en la existencia de receptores específicos en las membranas de los mohos sensibles y ausentes en los mohos resistentes. Los cationes podrían saturar estos receptores específicos e impedir que las proteínas se unieran a ellos y ejercieran su acción antifúngica.
PgChP muestra actividad hidrolítica sobre quitosán, lo que junto a la homología de su secuencia aminoacídica con otras quitosanasas fúngicas confirma que pertenece a este grupo de enzimas. Esta capacidad de PgChP para degradar quitosán puede hacer que su espectro de inhibición incluya a hongos con quitosán en su pared celular, como los géneros Rhizopus y Mucor, alterantes habituales en alimentos madurados. Además, las quitosanasas son utilizadas en la industria para la degradación de caparazones de moluscos, así como para la obtención de polímeros de quitosán, de alto valor como protectores frente a patógenos en alimentos, inhibidores de micotoxinas, purificadores de agua, etc.
Por otro lado, es necesario demostrar la inocuidad antes de proponer la aplicación de cualquier nueva proteína en alimentos. Aunque será necesario ampliar estos estudios, PgAFP y PgChP no mostraron evidencias de toxicidad sobre glóbulos rojos y larvas de Artemia salina a concentraciones superiores a las que poseen actividad antifúngica.
De forma general y como paso previo a la aplicación de una proteína a nivel industrial, resulta de gran importancia garantizar que la actividad antifúngica se mantiene en presencia de determinados compuestos que puedan estar presentes en el producto donde se vaya a aplicar. Adicionalmente el efecto de ciertos tratamientos a temperaturas o pHs extremos puede condicionar también sus posibles aplicaciones.
Ambas proteínas PgAFP y PgChP mostraron ser estables a altas temperaturas, permaneciendo activas tras ser sometidas a 100 ºC 15 minutos y 80 ºC 20 minutos, respectivamente. PgAFP además mostró ser estable a valores de pH entre 1 y 12.
La actividad antifúngica de PgAFP y PgChP se mantuvo en presencia de altas concentraciones (100 mM) de sodio y potasio, lo que puede ser de gran interés en alimentos madurados, donde abunda el cloruro sódico y puede haber otras sales de sodio y potasio. Los quelantes EDTA y EGTA no tuvieron un gran impacto en la actividad antifúngica de PgChP y PgAFP, mientras que el fosfato sódico a alta concentración (100 mM) sí pudo inhibir esta actividad. Los detergentes también inhibieron la actividad antifúngica de PgChP, pero PgAFP se mantuvo activa a concentraciones de tween 20 o de tween 80 más altas a las empleadas en los alimentos.
En definitiva, PgAFP y PgChP han mostrado alta estabilidad, han resultado ser inocuas en los ensayos realizados y resisten componentes comúnmente encontrados en alimentos. Aunque es necesario profundizar en su estudio, estas proteínas y las cepas de P.
chrysogenum que las producen muestran características adecuadas para su utilización frente a mohos alterantes y toxigénicos en alimentos crudos madurados.
- español
Se caracterizan dos proteínas con actividad antifúngica procedentes de dos cepas de la especie Penicillium chrysogenum y los genes que las codifican. Una de ellas es una quitosanasa. Además, se evalúa la resistencia de ambas proteínas a altas temperaturas, diferentes pHs, detergentes, cationes y quelantes de iones.
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Two proteins with antifungal activity and the encoding genes from two strains of Penicillium chrysogenum have been characterised. One of them is a chitosanase. In addition, the resistance to high temperatures, various pH values, detergents, cations, and ion chelators has been evaluated.
