Molecular tools to improve chestnut management: el bierzo as a case study
- Autores: Julia Quintana González
- Directores de la Tesis: Luis Gómez Fernández (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Politécnica de Madrid ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Fernando García Arenal (presid.), Juan Orellana Saavedra (secret.), Avelino García Álvarez (voc.), Anna María Vettraino (voc.), Manuel Gonzalo Claros Díaz (voc.)
- Materias:
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- Resumen
The European chestnut (Castanea sativa Mill.) is a multipurpose species that has been widely cultivated around the Mediterranean basin. New varieties were brought to the Iberian Peninsula during the Roman Empire, which coexist since then with native populations. The relevance of chestnut cultivation has being steadily growing since the Middle Ages, until the rural decline of the past century put a stop to this trend. Forest fires and diseases were also major factors. Chestnut cultivation is gaining momentum again due to its economic (wood, fruits) and ecologic relevance, and represents currently an important asset in many rural areas of Europe. In this Thesis we apply different molecular tools to help improve current management strategies. For this study we have chosen El Bierzo (Castile and Leon, NW Spain), which has a centenary tradition of chestnut cultivation and management. Moreover, its nuts are widely appreciated in Spain and abroad for their organoleptic properties. We have focused our experimental work on two major problems faced by breeders and the industry: the lack of a fine-grained genetic characterization and the need for new strategies to control blight disease.
To characterize the genetic diversity and structure of El Bierzo orchards, we analyzed DNA from 169 grafted trees covering the entire region. We also analyzed 62 nuts from all traditional varieties. El Bierzo constitutes an outstanding scenario to study chestnut genetics and the influence of human management because: (i) it is located at one extreme of the distribution area; (ii) it is a major glacial refuge for the native species; (iii) it has a long tradition of human management; and (iv) its geographical setting ensures an unusual degree of genetic isolation. Thirteen microsatellite markers provided enough informativeness and discrimination power to genotype at the individual level. Together with an unexpected level of genetic variability, we found evidence of genetic structure, with three major gene pools giving rise to the current population. High levels of genetic differentiation between groups supported this organization. Interestingly, genetic structure does not match with spatial boundaries, suggesting that the exchange of material and cultivation practices have strongly influenced natural gene flow. The microsatellite markers selected for this study were also used to classify a set of 62 samples belonging to all traditional varieties. We identified several cases of synonymies, evidencing the need to substitute traditional classification systems with new tools for genetic profiling.
The avenue of high-throughput sequencing technologies, combined with the development of bioinformatics tools, has paved the way to study transcriptomes without the need for a reference genome. We took advantage of RNA sequencing and de novo assembly tools to determine the transcriptional landscape of chestnut in response to blight disease. In addition, we have selected a set of candidate genes with high potential for developing resistant varieties via genetic engineering. Our results evidenced a deep transcriptional reprogramming upon fungal infection. The plant hormones ET and JA appear to orchestrate the defensive response and we also suggest a role for auxins as modulator. Many transcription factors were identified in this work that interact with promoters of genes involved in disease resistance. Among these genes, we have conducted a functional characterization on a major thaumatin-like protein (TLP) that belongs to the PR5 family.
Two genes encoding chestnut cotyledon TLPs have been previously described, termed CsTL1 and CsTL2. We substantiate here their protective role against blight disease for the first time, including in silico, in vitro and in vivo evidence. The synergy between TLPs and other antifungal proteins, particularly endo-ß-1,3-glucanases, bolsters their interest for future control strategies based on biotechnological approaches.
RESUMEN El castaño europeo (Castanea sativa Mill.) es una especie forestal que ha sido ampliamente cultivada en el área mediterránea. Durante la expansión del Imperio Romano, se distribuyeron en la Península nuevas variedades, que coexisten desde entonces con poblaciones nativas que sobrevivieron a la última glaciación. La relevancia del cultivo del castaño ha ido en aumento desde la Edad Media, aunque esta tendencia se ha visto mermada por el abandono del medio rural. No obstante, el cultivo está volviendo a ganar importancia debido a su potencial económico (fruto, madera) y ecológico, y representa en la actualidad un revulsivo importante en zonas rurales. En esta Tesis se pretende aplicar diferentes herramientas moleculares para mejorar la situación del castaño. Para ello, hemos escogido la región de El Bierzo (Castilla y León, Noroeste de España), donde existe una tradición centenaria de cultivo y manejo. Además, sus castañas son ampliamente apreciadas por sus propiedades organolépticas. Hemos centrado el desarrollo experimental de este trabajo en dos problemas fundamentales: la falta de caracterización genética y la necesidad de nuevas estrategias de control de la enfermedad del chancro.
Para caracterizar la diversidad genéticas de los sotos bercianos, hemos analizado una muestra representativa de su distribución (169 árboles injertados). Además, hemos genotipado 62 castañas pertenecientes a variedades locales. El Bierzo constituye un magnífico escenario porque: (i) está localizado en el extremo occidental del área de distribución de la especie; (ii) es un refugio glacial de especies nativas; (iii) tiene una larga tradición de cultivo del castaño; (iv) sus características geográficas contribuyen a un alto grado de aislamiento genético. Trece marcadores microsatélite han mostrado un poder discriminatorio e informativo suficiente para gentotipar a nivel de individuo. Junto con un alto grado de variabilidad genética, hemos evidenciado la existencia de tres grandes grupos genéticos altamente diferenciados. Cabe resaltar que esta diferenciación no se corresponde con una organización espacial clara, lo que demuestra que el intercambio de material y la propagación del mismo ha influido fuertemente el flujo génico. Los marcadores seleccionados fueron empleados más adelante para clasificar 62 castañas pertenecientes a variedades locales. Hemos identificado varios casos de sinonimia, evidenciando la necesidad de complementar los sistemas tradicionales de clasificación con nuevas herramientas para establecer perfiles genéticos.
La llegada de técnicas de secuenciación de segunda generación, combinadas con el desarrollo de potentes herramientas bioinformáticas, ha facilitado el estudio de transcriptomas sin la necesidad de una especie de referencia. Hemos empleado RNA-seq y el ensamblaje de novo para determinar el perfil transcripcional del castaño en respuesta a la enfermedad del chancro. Además, hemos seleccionado una serie de genes candidatos para el desarrollo de variedades resistentes con ingeniería genética. Nuestros resultados ponen de manifiesto una profunda reprogramación transcripcional como consecuencia de la infección. Las hormonas ET y JA parecer orquestar las rutas de señalización que median este proceso. Es reseñable que las auxinas parecen jugar también un papel importante. Muchos factores de transcripción que interaccionan con los promotores de genes implicados en defensa fueron identificados en este trabajo. Entre estos genes, hemos centrado nuestra atención en las proteínas de tipo taumatina (TLPs), que pertenecen a la familia PR5.
Dos genes que codifican para TLPs, CsTL1 y CsTL2, habían sido previamente descritos como proteínas cotiledonares mayoritarias con potencial antifúngico. Hemos profundizado en su caracterización y en su papel protector frente a la infección por C. parasitica. La sinergia entre TLPs y otras proteínas antifúngicas, particularmente glucanasas, evidencia su interés para el control de esta enfermedad.
