Resumen de Estudio de la regulación del factor de iniciación de la traducción eif4e mediante su interacción con la proteína ceres
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La regulación de la traducción de proteínas es un proceso determinante en el cómputo final de la expresión génica en plantas, ya sea durante los diferentes estadios de desarrollo o frente a diferentes condiciones ambientales. En este estudio hemos demostrado que, ante condiciones de estrés por calor, se produce un bloqueo general de la traducción acompañado de una traducción diferencial de ARN mensajeros relacionados con respuesta a estrés y con la síntesis de proteínas. Dicha regulación tendría como objetivo la protección de los sistemas celulares frente a diferentes estreses impidiendo la acumulación de proteínas mal plegadas y la muerte celular.
Para descubrir los mecanismos que rigen esta respuesta en plantas hemos profundizado en el estudio de la regulación de la traducción dependiente del factor de iniciación eIF4E. En concreto, nos hemos centrado en la identificación y la caracterización de proteínas que se unen con alta afinidad a eIF4E y que compiten con eIF4G por dicha unión, inhibiendo la formación del complejo eIF4F y la traducción proteica. A pesar de que esta regulación ha sido ampliamente estudiada en otros eucariotas, en plantas no se han descrito mecanismos de regulación similares hasta la fecha.
La búsqueda mediante escrutinio de doble híbrido de reguladores de la función de eIF4E1 de plantas permitió la identificación de CERES, una proteína LRR específica del reino vegetal no caracterizada hasta la fecha. Ensayos en el sistema de doble hibrido e inmunoprecipitaciones in planta demuestran que CERES interacciona con alta fortaleza con los factores eIF4E1 y eIF(iso)4E a través de un sitio de unión a eIF4E (4E-BS) conservado. Este dominio, presente en los eIF4Gs de eucariotas, media la interacción de los mismos con los factores eIF4E. Estos datos sugerían que CERES podría competir con los factores eIF4G en su unión a eIF4E. De acuerdo con esto, en este trabajo se ha demostrado que la formación del complejo eIF4E1-CERES excluye al factor eIF4G sin perjuicio de la interacción entre eIF4E y la estructura “cap” de los ARN mensajeros. Este mecanismo es similar al que ejercen otros reguladores de la función de eIF4E previamente descritos en otros eucariotas. Sin embargo, a diferencia de algunos importantes reguladores de eIF4E de mamíferos la actividad de CERES no parece estar sujeta a un control por fosforilación por el complejo TORC1. El análisis de la localización subcelular de CERES reveló que ésta colocaliza con los factores eIF4Es en citoplasma, en núcleo y en gránulos de estrés, indicando que dicha interacción podría tener un papel relevante en condiciones adversas. Además, el análisis pormenorizado del dominio LRR de CERES a través del uso de construcciones truncadas de la misma en ensayos de coinmunoprecipitación reveló que este dominio media la interacción con otro factor de iniciación de la traducción, eIF4A. Esto refuerza la hipótesis de que CERES tiene un papel en la traducción proteica. Curiosamente, el análisis de líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan la proteína quimérica CERES-GUS bajo el control del promotor de CERES ha revelado que dicha proteína se acumula en regiones altamente proliferativas, como los ápices radiculares o estructuras florales inmaduras, sugiriendo que el papel desempeñado por CERES podría estar relacionado con el desarrollo de estos tejidos. Sin embargo, en base a que no hemos podido asociar la pérdida de función o la sobreexpresión de CERES a un fenotipo claro en las condiciones ensayadas ni a variaciones en la traducción global de ARN mensajero, hipotetizamos que previsiblemente, CERES podría modular preferencialmente la traducción de mensajeros específicos en los tejidos donde se expresa, en lugar de modular la traducción del conjunto global de ARN mensajeros. Para determinar dichos mensajeros se está llevando a cabo un análisis de huella ribosomal que nos permitirá determinar si la sobreexpresión o la ausencia de CERES tiene un efecto en la traducción de mensajeros concretos y la identificación de los mismos.
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ABSTRACT Translational regulation has emerged as a pivotal process for gene expression during different developmental stages and environmental conditions. In the present work, we have demonstrated that plants subjected to heat stress undergo a general translational blockage, but also a differential translation of specific mRNAs related to protein synthesis and stress response. This response could aim at the protection of cellular systems while preventing the accumulation of misfolding proteins and cell death.
In order to decipher the mechanisms behind this response, we have deepened the study of the eIF4E-dependent translational inhibition. In particular, we have focused on the identification and characterization of high-affinity eIF4E binding proteins that compete with eIF4G for eIF4E binding, and that therefore, inhibit the assembling of the eIF4F complex and protein translation. Despite this pathway has been widely described in other eukaryotes, similar regulatory mechanisms remain elusive in plants to date.
In order to find out putative regulators of plant eIF4E, we have carried out a yeast two hybrid screening using AteIF4E1 as bait. This study resulted in the identification of CERES, an uncharacterized plant-specific protein that belongs to the LRR-protein family. Directed yeast two-hybrid and in vivo coimmunoprecipitation assays showed that this protein strongly interacts with eIF4E through a completely conserved eIF4E-binding site (4E-BS). This domain, which is found in the eIF4G proteins, mediates their interaction with eIF4E factors. These results suggested that CERES might compete with eIF4G for eIF4E binding. According to this hypothesis, we have also demonstrated that eIF4E1-CERES interaction prevents eIF4G from binding to eIF4E, and that, according to the available data from previously described eIF4E interactors in other eukaryotes, this interaction does not interfere with the eIF4E-cap binding. However, in contrast to some important described interactors in mammals, CERES does not seem to be subjected to a phosphorylation regulation by TORC1 complex. In the present work, we have also tested the subcelular localization of CERES. CERES colocalizes with eIF4E factors in the cytoplasm, nucleus and stress granules, indicating than both proteins share the same subcelular localization, but also suggesting that CERES could have a role modulating eIF4E under stress conditions. A detailed analysis by immunoprecipitation assays of truncated versions of CERES revealed that the LRR domain is involved in protein-protein interactions with the translation initiation factor eIF4A. This result is in agreement with our hypothesis that supports that CERES could have a role in protein translation regulation. Interestingly, the analysis of stable transgenic Arabidopsis lines expressing CERES-GUS under the control of the CERES promoter has revealed that this protein is accumulated specifically in highly proliferative tissues, as the meristem apex of the main and lateral roots and immature reproductive structures. This expression pattern suggests that CERES could play an important role on the development of these tissues. Nevertheless, the lack of neither a clear phenotype nor an alteration in the global levels of actively translated messengers in mutant and overexpressor lines suggest that, instead of modulating the overall pool of mRNAs, CERES could mediate the translation of specific mRNAs in the tissues where it is expressed. In order to determine if CERES has a role on the translation of specific mRNA targets, we are currently carrying out a ribosome-profiling analysis in CERES´ mutant and overexpressor lines.
