Se han producido por primera vez in planta, nanopartículas derivadas del Virus del mosaico del nabo (TuMV), un potyvirus. Estas nanopartículas virales (VNPs) pueden ser utilizadas como armazones para la generación de anticuerpos; como herramientas de diagnóstico; inmunización; o como biomateriales. Se han desarrollado dos tipos de VNPs de TuMV: las que contienen ácidos nucleicos (viriones) y las que no (partículas “tipo virus” vacías, eVLPs); y se les han introducido modificaciones mediante dos aproximaciones: conjugación química o genética. En resumen, este es el primer caso documentado de conjugación química en VNPs o genética en eVLPs de potyvirus hechas in planta. Las VNPs fueron producidas por inoculación de Brassica juncea con TuMV o mediante agroinfiltración de Nicotiana benthamiana con el cDNA de la proteína de la cápside (CP) de TuMV en un vector pEAQ de alta expresión de proteínas y subsecuente auto-ensamblado de la CP en células de plantas. Como prueba de concepto para la modificación genética de VNPs se seleccionó un péptido del receptor del factor de crecimiento vascular endotelial 3 (VEGFR-3) y un péptido del receptor de la trombina (TR). Para la conjugación química, un péptido vasoactivo intestinal (VIP) y compuestos de bajo peso molecular (I-AEDANS, biotina y un compuesto organometálico). Se obtuvo una producción significativa de eVLPs y viriones de TuMV. Las VNPs (eVLPs modificadas genéticamente con TR o viriones conjugados químicamente con biotina) fueron capaces de incrementar en órdenes de magnitud la capacidad de detectar anticuerpos, en comparación con péptido TR o biotina libre. Esto también se observó en modelos de ratas con fibrosis hepática mediante la utilización de viriones modificados genéticamente con el péptido VEGFR-3 en comparación con el péptido VEGFR-3 libre.
Este trabajo pone de manifiesto la posibilidad de conjugar, genética o químicamente, péptidos y compuestos de bajo peso molecular a viriones del Virus del mosaico del nabo, o sus eVLPs; lo que demuestra su potencial en numerosas aplicaciones nanobiotecnológicas.
ABSTRACT In this thesis, plant-made nanoparticles derived from Turnip mosaic virus (TuMV), a potyvirus, were developed. These Viral Nanoparticles (VNPs) can be exploited as scaffolds for building modified nano-objects and can be used as diagnostic tools, for antibody generation, immunization, or as biomaterials in general. They fall into two biological categories: either enclosing a nucleic acid (virions) or without the nucleic acid (empty virus-like particles, eVLPs). The modifications imposed on VNPs can also be achieved by two main approaches: genetic or chemical conjugation. Each of them has particular pros and cons for nanotechnological deployment. Overall, this is the first case of genetic or chemical conjugation in plant-made potyvirus VNPs. The VNPs were produced either by inoculation of Indian mustard (Brassica juncea) with the infectious TuMV virus, or by agroinfiltration of the tobacco relative Nicotiana benthamiana with the TuMV coat protein cDNA (CP) on a pEAQ vector for high protein expression and subsequent CP self-assembly within plant cells. As a proof-of-concept, a vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR-3) peptide and a human thrombin receptor peptide (TR) were chosen for the genetic modification of VNPs. For the chemical modification, a vasoactive intestinal peptide and low-molecular-weight compounds (I-AEDANS, biotin and an organometallic complex) were selected. Significant production of TR-CP VLPs and TuMV virions was obtained from plant leaves. VNPs proved capacity to log-increase the ability of antibody-sensing compared to free TR peptide or free biotin. This was also the case for VEGFR-3-conjugated VNPs for the detection of autoantibodies in sera of rats with induced liver fibrosis.
In this thesis, the possibility of conjugating, genetically and chemically, peptides and low-molecular-weight compounds to Turnip mosaic virus virions or VLPs is demonstrated. This outlines the potential of these VNPs for their use in numerous nanobiotechnological applications.
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