Resumen de Caracterización de una nueva proteína hipertermófila nifb y su papel en el mecanismo de síntesis de nifb-co, precursor del grupo metálico de femo-co
Versión en Español La generación de plantas capaces de expresar la enzima bacteriana nitrogenasa, y por lo tanto utilizar el nitrógeno atmosférico sin depender de interacciones simbióticas con bacterias diazotróficas, es de enorme interés agronómico. Uno de los principales obstáculos para la ingeniería de la nitrogenasa en un huésped no diazotrófico es el logro de actividad NifB. La proteína NifB es extremadamente inestable y sensible al oxígeno. NifB es una proteína radical SAM que cataliza una reacción de bajo potencial redox. El producto de la actividad NifB se llama NifB-co, un agrupamiento con composición [8Fe-9S-C] que sirve como intermediario obligado en la biosíntesis de los cofactores presentes en los sitios activos de todas las nitrogenasas conocidas, por ejemplo el cofactor de hierro y molibdeno (FeMo-co). De hecho, NifB utiliza dos equivalentes de SAM para insertar un átomo de carburo y fusionar dos grupos [Fe-S] formando NifB-co. En esta tesis se estudia la diversidad y la filogenia de las proteínas naturales NifB, su arquitectura, y las funciones de sus diferentes dominios con el fin de entender lo que define una NifB catalíticamente activa. A continuación, el trabajo se centra en NifB del termófilo Methanocaldococcus infernus (NifBMi), elegido por su arquitectura de un solo dominio, facilidad de expresión heteróloga en Escherichia coli, y estabilidad en estado puro. Se demuestra que NifBMi es funcional in vivo, utilizando ensayos de complementación genética de mutantes de Azotobacter vinelandii. También se demuestra que NifBMi es una enzima SAM radical capaz de romper reductivamente SAM a 5'-desoxiadenosina radical y es competente en síntesis de FeMo-co y reconstitución de nitrogenasa in vitro. Utilizando espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica en colaboración con el grupo de David Britt en la Universidad de California-Davis, hemos caracterizado tres agrupamientos [4Fe-4S]: uno catalítico unido a la molécula SAM y dos auxiliares que probablemente actúan como sustratos para la formación de NifB-co. Se observó coordinación de nitrógeno a uno o más de los agrupamientos auxiliares de NifB proporcionando datos mecanísticos sobre el inicio de la reacción de NifB. Además se realizaron ensayos de cristalización en condiciones anóxicas en colaboración con el laboratorio del Prof. Juan Fontecilla-Camps en el IBS de Grenoble. Aunque no se consiguieron cristales de calidad suficiente para ensayos de difracción de rayos X, se establecieron las bases para posteriores rastreos de condiciones de cristalización.
English version The generation of plants capable of expressing the bacterial enzyme nitrogenase, and hence using atmospheric nitrogen without relying on symbiotic interactions with diazotrophic bacteria, is of great agronomic interest. One of the main obstacles to engineering nitrogenase in a non-diazotrophic host is the achievement of NifB activity. The NifB protein is extremely unstable and sensitive to oxygen. NifB is a SAM radical protein that catalyzes a reaction with low redox potential. The product of the NifB activity is called NifB-co, a metal group with composition [8Fe-9S-C] that serves as an obligate intermediate in the biosynthesis of the cofactors present in the active sites of all the known nitrogenases, for example the iron and molybdenum cofactor (FeMo-co). In fact, NifB uses two SAM equivalents to insert a carbide atom and merge two [4Fe-4S] groups into NifB-co. In this thesis we study the diversity and phylogeny of NifB natural proteins, their architecture, and the functions of their different domains in order to understand what defines a catalytically active NifB. Next, the work focuses on NifB of the thermophilic archaea Methanocaldococcus infernus (NifBMi), chosen for its single domain architecture, heterologous expression ease in Escherichia coli, and stability in purified form. By using genetic complementation assays of Azotobacter vinelandii mutants, it is shown that NifBMi is functional in vivo. It is also shown that NifBMi is a radical SAM enzyme capable of reductively breaking SAM to radical 5'-deoxyadenosine and is competent in FeMo-co synthesis and reconstitution of nitrogenase in vitro. Using electron paramagnetic resonance spectroscopy in collaboration with the David Britt group at the University of California-Davis, we have characterized three [4Fe-4S] clusters: one catalytic cluster bound to the SAM molecule and two auxiliary clusters that probably act as substrates for the formation of NifB-co. Nitrogen coordination was observed in one or more of NifBMi auxiliary clusters providing mechanistic data on the initiation of NifB reaction. In addition, crystallization tests were carried out under anoxic conditions in collaboration with the laboratory of Prof. Juan Fontecilla-Camps at the IBS of Grenoble. Although crystals of sufficient quality for X-ray diffraction tests were not obtained, the bases were established for further screenings of crystallization conditions.
