Regulación fisiológica mitocondrial y de señalización autofágica a través de intervenciones nutricionales con diferentes fuentes lipídicas y antioxidantes

• Autores: Elena Gutiérrez Casado
• Directores de la Tesis: José Manuel Villalba Montoro (dir. tes.), Antonio José González (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Isabel Burón Romero (presid.), Francisco Javier Alcain Tejada (secret.), Manuel Pires (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Córdoba
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Helvia
• Resumen

  • 1. Introducción o motivación de la tesis La autofagia es un proceso intracelular por el que se degradan partes de citoplasma, orgánulos como mitocondrias y peroxisomas, agregados proteicos y agentes infecciosos, por acción de los lisosomas. Se han definido tres tipos de autofagia: macroautofagia (designada de aquí en adelante como autofagia), microautofagia y autofagia mediada por chaperonas (CMA). La autofagia comienza con el aislamiento de una sección de membrana conocido como fagóforo, que puede originarse a partir de bicapas lipídicas procedentes de retículo endoplásmico (RE), y/o de la red trans del complejo de Golgi, así como de endosomas [1, 2]. Este proceso está regulado por la acción de diversos complejos multiproteicos que actúan en la formación de las vesículas autofágicas que contendrán el material a degradar, denominadas autofagosomas. El primer complejo que facilitará el aislamiento de membrana es el de “pre-iniciación”, compuesto por la quinasa ULK1y las proteínas ATG13, ATG101 y FIP200. Éste, a su vez, actuará sobre el complejo de iniciación formado por VPS34, VPS15, Beclina 1 y ATG14, que permitirá el ensamblado de la maquinaria de elongación del fagóforo. Posteriormente, dos sistemas de conjugación similares a los de ubiquitinación trabajarán en la elongación del fagóforo y la posterior maduración del autofagosoma. La primera reacción de conjugación dará lugar al complejo ATG12/ATG5/ATG16L1, y éste a su vez participará en la conjugación de las proteínas de la familia ATG8, y concretamente de LC3, con el lípido fosfatidiletanolamina (PE), procesos que determinarán la elongación del fagóforo, la hemifusión de sus extremos dando lugar a los autofagosomas y la posterior maduración del mismo [3, 4]. Una vez maduras, estas vesículas se unen con los lisosomas para la degradación de su contenido, proceso facilitado por la acción del citoesqueleto [5] y de proteínas tales como RAB7 [3]. La regulación del proceso está mediada por sensores metabólicos celulares entre los que destacan la quinasa AMPK, que actúa como regulador positivo de dicha ruta y el complejo mTORC1, que la regula negativamente. Ambas actúan de forma directa o indirecta sobre la proteína ULK1 [6]. También se producen modificaciones post-traduccionales sobre el complejo de iniciación, concretamente sobre la proteína Beclina 1, que también intervienen en la regulación del proceso [7-9].

    El proceso autofágico puede ser no específico en condiciones de deprivación de nutrientes o, estar dirigido a orgánulos celulares concretos. Cuando se dirige de forma específica a la mitocondria se conoce como mitofagia, que puede producirse por dos vías fundamentalmente: una mediada por la proteína BNIPL/NIX, que actúa en los procesos madurativos de algunas líneas celulares, y otra mediada por las proteínas PINK1/Parkin, que se encarga del recambio de mitocondrias no funcionales [10]. En este último caso también participa de manera activa la proteína p62 [11].

    Otro punto importante del presente trabajo trata sobre las especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés Reactive Oxygen Species), término que se utiliza para referirse a diversos derivados reactivos del oxígeno, sean o no radicales libres [12]. Las principales ROS que podemos encontrar a nivel celular son el radical hidroxilo (OH·), el radical superóxido (O2·-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2). Éstas interaccionan con las principales biomoléculas celulares causando daño en el ADN, proteínas [13] y lípidos [14] dando lugar a numerosos procesos deletéreos.

    La mitocondria juega un papel fundamental en el metabolismo celular pues es la encargada de generar ATP mediante la acción de la cadena de transporte electrónico (CTE), compuesta por un conjunto de complejos multiproteicos localizados en la membrana mitocondrial interna (IMM) [15, 16]. Además, la mitocondria ha sido identificada como una de las principales fuentes de ROS a nivel celular [17, 18]. Concretamente, la formación de O2·-dentro de la CTE se concentra principalmente en dos puntos: el complejo I (NADH-deshidrogenasa) destacándose los mononucleótidos de flavina y centros ferrosulfurados como los responsables de liberar O2·- hacia la matriz mitocondrial, y el complejo III (Ubiquinol:citocromo c óxido-reductasa), que produce esta especie reactiva a partir del ciclo del coenzima Q hacia el lado citosólico de la IMM [19, 20]. La producción de ROS parece deberse al estancamiento de los electrones en los complejos producido cuando la ratio de entrada de los mismos excede el ritmo de paso de los electrones por los componentes de la cadena [21].

    En la presente Tesis se analiza también el papel de diferentes compuestos fenólicos en procesos como autofagia y función mitocondrial. Los compuesto fenólicos, metabolitos secundarios de las plantas, presentan en su estructura un anillo aromático acompañado de uno o más grupos hidroxilo [22], y se clasifican atendiendo a distintos criterios tales como su abundancia, origen, función biológica y estructura química. En función de su abundancia pueden clasificarse en dos grupos: los flavonoides y los no flavonoides. Los primeros son los más abundantes y se caracterizan por poseer 15 carbonos y dos anillos aromáticos conectados entre ellos por 3 puentes de carbono. Diversos estudios han demostrado la gran capacidad antioxidante de los flavonoides [23, 24], por lo que su consumo está asociado con un menor riesgo de sufrir cáncer o enfermedades cardiovasculares [25]. Además, también tienen capacidad de mitigar el daño oxidativo en el ADN y de prevenir la peroxidación lipídica en una gran cantidad de tipos celulares [26, 27]. No obstante, a concentraciones elevadas pueden actuar como pro-oxidantes induciendo procesos como la apoptosis [24, 28, 29]. Dentro de estos compuestos, el kaempferol (3,5,7,4-tetrahidroxiflavona) es un flavonol presente en gran cantidad de vegetales y frutas, que muestra una gran cantidad de funciones biológicas entre las que destaca su capacidad antiinflamatoria [30]. Numerosos estudios realizados en distintas líneas celulares han determinado el efecto de esta sustancia mitigando la producción de ROS [31, 32]. No obstante, el tratamiento con ella a altas concentraciones y durante periodos largos incrementa la producción de dichas especies en otros modelos de estudio [33, 34]. Este compuesto puede actuar, además, como modulador de la ruta de autofagia actuando sobre diferentes dianas, favoreciendo con ello procesos tan diversos como la protección celular frente a distintos tipo de estrés o la diferenciación celular [33, 35, 36].

    Otra molécula importante sobre la que hemos centrado nuestras investigaciones, es el coenzima Q (Q), lípido cuya estructura comprende un anillo benzoquinónico conectado a una cola lateral de isoprenos [37]. Esta molécula desempeña numerosas funciones que pueden dividirse entre las que realiza a nivel local en la mitocondria, y las que lleva a cabo en otros compartimentos celulares. En la mitocondria, podemos encontrarla formando parte de la CTE actuando como transportador electrónico [38]. Además, actúa como cofactor de proteínas desacoplantes (UCPs), previene la apertura del poro de transición de permeabilidad (PTPm) y puede actuar como aceptor final de electrones en la síntesis de pirimidinas [39]. En cuanto a sus funciones extra-mitocondriales, forma parte del sistema rédox de la membrana plasmática (PMRS) y constituye parte de la defensa antioxidante no enzimática junto a otras moléculas como los flavonoides o el glutatión.

    Los ácidos grasos son biomoléculas compuestas por un grupo carboxilo unido a una cadena hidrocarbonada, que suelen encontrarse formando parte de moléculas lipídicas más complejas, siendo componentes fundamentales de las membranas biológicas. Pueden clasificarse en dos tipos atendiendo a la presencia de dobles enlaces (insaturaciones) en su cadena hidrocarbonada: ácidos grasos saturados (SFA), que carecen de dobles enlaces, e insaturados, que sí los poseen. Dentro de estos últimos se pueden distinguir dos subgrupos en función de si presentan un único doble enlace, denominándose ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), o varios, denominándose entonces ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). Ante la imposibilidad de las células de sintetizar ciertos tipos de ácidos grasos necesarios para las funciones biológicas, éstos son captados a partir de la dieta. A estos ácidos grasos se les conoce como “ácidos grasos esenciales” (EFA), y se clasifican principalmente en dos familias: la serie n-3 y la serie n-6. Diversos estudios han determinado la capacidad de las membranas celulares para adaptar su composición lipídica en función de la grasa predominante presente en la dieta [40-42], lo que puede conllevar una serie de alteraciones bioquímicas en las células y en especial en las membranas mitocondriales [43]. De esta forma, las grasas ricas en PUFA, como el aceite de soja y pescado, dan lugar a membranas que son más susceptibles de sufrir daño oxidativo, pues los carbonos que forman parte de las insaturaciones son más propensos a ello, que las grasas ricas en SFA y MUFA, como la grasa animal o el aceite de oliva respectivamente. Es por ello que estas alteraciones en el lipidoma pueden relacionarse con procesos como el envejecimiento [44].

    Numerosos estudios han sugerido que los ácidos grasos pueden regular el proceso autofágico. Por ejemplo, el ácido palmítico (PA) incrementa este proceso en células β pancreáticas INS-1 de rata protegiéndolas de la apoptosis. No obstante, otros investigadores han determinado que es el ácido oleico (OA), y no el PA, el que favorece la formación de vesículas autofágicas incrementando también la expresión de proteínas relacionadas con este mecanismo en células HepG2 y hepatocitos primarios de ratón. La autofagia inducida por los PUFA de la serie n-3, contribuye a una recuperación más eficiente del daño renal inducido por isquemia/reperfusión en ratones Fat-1. Además, el aumento en la eficiencia de esta ruta promovido por estos ácidos grasos favorece la citotoxicidad en células tumorales favoreciendo la apoptosis. Por último, los ácidos grasos de la serie n-6 favorecen el flujo autofágico, lo que parece estar relacionado con el incremento de la longevidad en C. elegans [45].

    Otro punto fundamental del presente trabajo es el estudio de diferentes intervenciones nutricionales sobre el envejecimiento, y más concretamente sobre la relación de éste con la ruta de autofagia. El envejecimiento puede definirse como la pérdida progresiva de función en los distintos tejidos de un organismo debido a la degradación de sus componentes a nivel molecular dependiente del tiempo, lo que implica una menor fertilidad y un aumento en la susceptibilidad de sufrir gran número de enfermedades de diversa índole [46]. Aunque no exenta de controversia, la denominada “Teoría de los Radicales Libres” sobre el envejecimiento [47] proporciona unas bases sólidas para explicar dicho proceso. En ella se postula que la producción de ROS, sobre todo a nivel mitocondrial, daña progresivamente distintas biomoléculas celulares. La imposibilidad de la célula de contrarrestar este daño oxidativo mediante la respuesta antioxidante resulta en la acumulación de lesiones y, en última instancia, en la pérdida de funcionalidad de estos componentes. En estrecha relación con esta teoría se encuentra la hipótesis que propone que las características de los lípidos que conforman las membranas celulares condicionan la intensidad del daño oxidativo al que se ven expuestas afectando, por tanto, al envejecimiento y la longevidad. Diversos estudios comparativos han determinado que en animales con una menor longevidad máxima aparece un mayor índice de dobles enlaces (DBI) en los lípidos de membrana [48, 49].

    La restricción calórica (RC), es decir, una disminución en la ingesta de calorías sin malnutrición, es la intervención no genética ni farmacológica que de forma más fehaciente es capaz de incrementar la longevidad y favorecer un envejecimiento saludable en diversas especies [50, 51]. Esta intervención puede actuar disminuyendo la producción de ROS, potenciando la respuesta antioxidante encargada de la eliminación de las mismas y promoviendo también la corrección de los daños inducidos por ellas [52]. Puesto que la mitocondria es una de las principales fuentes de generación de ROS, parte de los efectos beneficiosos de la RC sobre la longevidad provienen, muy probablemente, de una mejora en la función mitocondrial [53]. Además, esta intervención puede redistribuir el tipo de insaturación de los ácidos grasos predominante en ciertos tejidos, haciendo que las membranas sean menos susceptibles al daño oxidativo [54, 55].

    Ha sido ampliamente establecido que durante el envejecimiento se produce una disminución en la capacidad proteolítica celular considerada responsable, al menos en parte, de la acumulación de componentes celulares dañados en los tejidos de animales viejos. En diversos tejidos, como corazón, cerebro, hígado, músculo y riñón, se han observado determinadas características morfológicas (como la expansión de los compartimentos lisosomales, acumulación de vacuolas y deposición de material no digerido rico en lipofucsina) que apuntan a una pérdida de eficiencia en la ruta de autofagia en animales viejos [56]. Otras investigaciones llevadas a cabo mediante abordajes genéticos en distintos modelos de estudio han determinado que la falta de funcionalidad de ciertos genes relacionados con la autofagia da lugar a fenotipos asociados al envejecimiento, provocando en algunos casos una disminución en la longevidad máxima en dichos organismos. Defectos en la ruta de autofagia han sido asociados también a enfermedades que presentan una alta prevalencia en la población envejecida: desórdenes neurológicos, cáncer, distintos procesos de inmunosenescencia, así como miopatías (revisado en [57]). Existen indicios de que la RC introduce mejoras en el proceso autofágico, ya que individuos sometidos a esta intervención presentan una menor cantidad de componentes celulares y biomoléculas dañadas que los que son alimentados ad libitum [57]. Se ha descrito, además, que la RC induce alteraciones en la ruta autofágica por la activación de dos “sensores energéticos a nivel celular”: AMPK [6, 57-59] y sirtuina 1, los cuales establecen un bucle de retroalimentación positiva para su activación mutua [60]. Además, esta intervención promueve procesos autofágicos inhibiendo la ruta de señalización mediada por factores de crecimiento similares a insulina, lo que resulta finalmente en la inhibición de mTOR [60]. El recambio de mitocondrias mediante el proceso de mitofagia se ve favorecido también por esta intervención nutricional, pues incrementa la expresión de proteínas relacionadas con este proceso (PINK1, Parkin y BNIP3L) en riñón de ratas viejas frente a otras alimentadas con una dieta altamente calórica [61]. Aunque parece evidente que un mejor funcionamiento de la ruta de autofagia previene la aparición de eventos asociados al envejecimiento, la activación persistente de esta ruta no parece ser una intervención anti-envejecimiento ideal, ya que investigaciones llevadas a cabo en ratones con progeria mostraron que dicho incremento contribuyó a la degeneración sistémica sufrida por estos animales [62].

    Por último, hay que recalcar la importancia de los procesos de dinámica mitocondrial, que permiten a las células adaptarse a los requerimientos de demanda energética, biogénesis de lípidos y síntesis de ácidos grasos, etc. en función de las condiciones del medio. Para ello, las mitocondrias están sujetas a modulación de sus propiedades dinámicas, pudiendo fusionarse, dividirse, moverse o anclarse a otros orgánulos como el RE [63]. En este proceso participa una familia de GTPasas incluida en la subfamilia DRPs. Dentro de éstas, en la fisión mitocondrial participan proteínas como Drp1 y Fis1, mientras que en la fusión juegan un papel fundamental las mitofusinas 1 y 2 (Mfn1 y Mfn2) y la proteína OPA1. Alteraciones en la maquinaría de dinámica mitocondrial han sido asociadas con numerosas patologías [64].

    Una de las principales motivaciones de la presente Tesis Doctoral es determinar el papel del Q en la fisiología mitocondrial y en la ruta de autofagia en distintos sistemas in vitro a través de intervenciones farmacológicas y nutricionales: En el primero de ellos, la línea celular Tkpts, se utilizaron sustancias capaces alterar los niveles de Q actuando como precursores de su síntesis endógena (kaempferol (K) y ácido para-hidroxibenzoico (pHB)), como inhibidores de la misma (ácido para-aminobenzoico (PABA)) o mediante aporte directo de un suplemento con Q10. Con el fin de estudiar estos mismos procesos celulares en otro modelo in vitro, la línea celular Hepa 1.6, las células fueron tratadas con distintas emulsiones lipídicas ricas en ácidos grasos de distinta naturaleza (ácidos grasos poliinsaturados de las series n-3 (Lipoplus) y n-6 (Lipofundina)) o en ácidos grasos monoinsaturados n-9 (ClinOleic)), también capaces de alterar los niveles de Q en estas células. La otra motivación esencial de este trabajo es analizar de qué manera la RC y el componente graso de la dieta modulan la ruta autofágica y el daño oxidativo en un modelo animal, ratones de la estirpe C57BL/6, centrándonos en un tejido post-mitótico (músculo esquelético) y en otro mitótico (hígado). Para ello, los animales se sometieron a una restricción calórica del 40% estableciéndose 4 grupos experimentales: uno control alimentado con el 95% de la ingesta ad libitum, previamente calculada para evitar la obesidad de los individuos, y tres sometidos a RC cuya fuente grasa fue distinta: en el grupo control (grupo Ctrl.Soy) y en uno de los grupos de RC (grupo CR.Soy) fue aceite de soja (rico en PUFA n-6), mientras que en los grupos de RC restantes la grasa fue aceite de pescado (rico en PUFA n-3, grupo CR.Fish) o manteca de cerdo (rica en SFA y MUFA n-9, grupo CR.Lard).

    2. Contenido de la investigación En la línea celular Tkpts, las subunidades de la CTE se regulan de manera diferencial en función de la procedencia endógena o exógena del Q, siendo el complejo III el que más se afecta por los niveles de esta molécula. Así, se observó un fuerte incremento en los niveles de este complejo en presencia de K y pHB, ambos precursores de la biosíntesis de Q, que fue prevenido cuando los tratamientos fueron combinados con PABA, inhibidor de la misma. Además, el tratamiento simple con PABA disminuyó por sí mismo los niveles de este complejo con respecto a los observados en células control. Estos resultados están en sintonía con estudios previos en levaduras que constataron la importancia de los niveles de Q en el mantenimiento de la función y estabilidad del complejo III [65]. En el caso del complejo I, se observó un incremento en sus niveles en presencia de los tratamientos con K, pHB y PABA, por lo que la regulación de esta subunidad podría estar relacionada con la homología estructural existente entre estas moléculas (estructuralmente, PABA difiere de pHB en un único sustituyente del anillo benzoico) [66]. En el caso de los complejos II y IV, los resultados indican que el PABA podría estar actuando como inhibidor de la expresión de estos complejos, pero sólo en presencia de sus análogos estructurales K y pHB, mientras que en el complejo V no se observaron cambios. Aunque también se observaron alteraciones de estas subunidades en presencia del aporte exógeno de Q10, éste sólo tuvo efecto a una concentración de 10 µM, mientras que no presentó efecto alguno a 2 µM. Este resultado puede indicar que la incorporación de Q10 exógeno hasta los compartimentos celulares donde lleva a cabo su función metabólica o señalizadora es poco eficiente, quedando la mayoría del Q10 exógeno secuestrado en un compartimento no relevante para estas funciones, como podría ser el compartimento lisosomal [67]. Además, nuestros resultados apoyan que el PABA ejerce efectos de regulación de la expresión de estas subunidades de forma independiente a su acción como inhibidor de la biosíntesis de Q, ya que incluso en células tratadas con concentraciones elevadas de Q10, los efectos son revertidos en las células tratadas simultáneamente con PABA.

    La función mitocondrial, determinada mediante el análisis del OCR y el ECAR, se ve afectada también por los niveles de Q. Concretamente, el tratamiento con PABA disminuye el OCR, resultado que concuerda con el hecho de que el Q es el único transportador electrónico capaz de donar electrones procedentes de los complejos I y II al III y, por ello, las alteraciones en los niveles de esta molécula, inducen modificaciones en la función mitocondrial [39]. La recuperación de este parámetro en presencia de un suplemento exógeno con Q10, parece indicar que a 10µM la cantidad de Q que alcanza la mitocondria favorece la recuperación de la ratio de consumo de O2. Por su parte, el tratamiento con K produjo cambios tanto en el OCR como en el ECAR, disminuyéndolos de manera independiente del efecto que esta sustancia tiene sobre los niveles de Q. Este efecto del K ha sido mostrado en otras líneas celulares [33]. La generación de O2·- mitocondrial disminuyó en células tratadas con K pero no con pHB, mientras que aumentó de manera considerable con la adición de PABA tanto de forma simple como combinada. Estos resultados indican que la acción de los compuestos fenólicos disminuyendo la producción de ROS mitocondriales, está relacionada con su capacidad como precursores biosintéticos del Q. No obstante, en el caso del tratamiento con pHB, su capacidad como precursor de síntesis de Q no parece ser suficiente para producir dichos efectos, lo que sugiere que podrían ser necesarias acciones adicionales, llevadas a cabo por K pero no por pHB. No obstante, a pesar de producir alteraciones en la generación de O2·- mitocondrial, ninguno de los tratamientos supuso alteraciones en el “oxi-proteoma” de estas células.

    En cuanto a dinámica mitocondrial, nuestros resultados indican que la regulación de las proteínas de fisión y fusión no parece implicar de forma clara a los niveles de Q. No obstante, el tratamiento con K podría favorecer el proceso de fisión en detrimento del de fusión en esta línea celular, ya que incrementa significativamente los niveles de Drp1 y disminuye los de Mfn1 y Mfn2. Estos resultados concuerdan con los observados en la línea celular SH-SY5Y, donde el tratamiento con 30 µM de K produjo cambios en la red mitocondrial de estas células, favoreciendo la pérdida de uniones con el RE y mostrando una morfología redondeada conocida como “donut”, acontecimientos predictivos de procesos de fisión [68].

    En la línea celular Tkpts, diversos marcadores de la ruta de autofagia presentaron respuestas diferenciales ante las alteraciones de los niveles de Q. Sin embargo, las proteínas mTOR y fosfo mTOR no parecen verse afectadas por estas alteraciones, posiblemente por la gran variedad de factores que actúan sobre este regulador maestro de la ruta [6, 59]. Beclina 1, por su parte, incrementó sus niveles sólo en presencia de un aporte exógeno de Q10, lo podría indicar que la regulación de esta proteína es independiente del aumento de los niveles endógenos de Q pero se afecta cuando el Q10 se acumula en un compartimento distinto, posiblemente el lisosomal [67]. Además, analizando los efectos del PABA, observamos que en todos los casos produce una disminución de Beclina 1 por lo que este efecto directo del tratamiento no está relacionado con su acción como inhibidor competitivo de la proteína COQ2. Estos resultados contrastan con los de otros autores que determinaron que en fibroblastos deficientes de Q, los niveles de mensajero de esta proteína se encontraban incrementados con respecto a sus respectivos controles [69]. Los niveles de la forma “nativa” de p62 no se alteraron por la adición de los tratamientos; no obstante, sus formas ubiquitiniladas se incrementaron en presencia del suplemento con Q10 exógeno, lo que podría indicar un aumento en la eficiencia de incorporación de proteínas ubiquitiniladas al fagóforo, o un ligero bloqueo del flujo autofágico que impida la degradación de las mismas. Por último, ambas formas de LC3 (LC3I y LC3II) incrementaron sus niveles en presencia de K y pHB, incremento que fue revertido cuando los tratamientos fueron combinados con PABA. Se observó la misma respuesta con el suplemento de Q10, no observándose cambios ulteriores por tratamiento combinado con Q10 más PABA. Estos resultados contrastan con los obtenidos por Rodríguez-Hernández et al., donde la deficiencia de Q en fibroblastos produjo un incremento de la forma LCII no variando los niveles de LC3I [69]. Determinaciones de flujo autofágico, medido a partir de determinaciones llevadas a cabo tanto en ausencia como en presencia de Cq, indicaron que los tratamientos con pHB y Q10 disminuyeron significativamente el flujo autofágico mientras que el PABA lo acrecentó notablemente con respecto al control. Una hipótesis que puede explicar estos resultados es que el aumento en los niveles de Q favorece el procesamiento de la forma primitiva de LC3 (pro-LC3) a LC3I y de ésta a su forma lipidada (LC3II), pero simultáneamente provocaría un bloqueo parcial en los pasos siguientes que dan lugar a la formación de autofagosomas. Estos resultados son compatibles con los ya mencionados de Rodríguez-Hernández et al., que proponen que la autofagia se activa como método de supervivencia ante el déficit de Q [69]. Para estudiar esta posible mejora en el procesamiento de pro LC3 a LC3I, abordamos el estudio de la enzima ATG4, que juega un papel fundamental en dicho procesamiento. Estudios recientes llevados a cabo en levaduras (S. cerevisie) han determinado que la acción de la tiorredoxina modula la actividad de la proteína Atg4 [70]. De esta manera, en esta línea celular los niveles de tiorredoxina 1 (Trx 1) aumentaron en presencia del tratamiento con K y pHB, disminuyendo cuando los tratamientos eran combinados con PABA. El aporte exógeno de Q10 también tendió a incrementar dichos niveles, no observándose cambios cuando el PABA estaba presente. Estos datos parecen indicar que la regulación de Trx 1 está mediada, al menos en parte, por un incremento en los niveles de Q. Una vez confirmado el efecto de nuestros tratamientos sobre Trx 1, profundizamos en el estudio de la proteína regulada por ésta, ATG4, utilizando un inhibidor de su actividad, el tioconazol (Tc) [71]. Ambas formas de LC3 se incrementaron nuevamente en presencia de Q10, observándose una disminución significativa con respecto al control en dichas formas con el tratamiento con Tc 5µM, siendo más llamativo en el caso de LC3I. El tratamiento combinado con Q+Tc no reestableció los niveles de estas proteínas, lo que indica la imposibilidad del Q para actuar en presencia del inhibidor de ATG4. No obstante, la determinación de los niveles de Trx 1 en presencia de Tc y el tratamiento combinado con Q+Tc, reveló que Trx1 se encontraba disminuida significativamente con respecto a las condiciones control, por lo que no podemos diferenciar cuál es el regulador directo que responde a las alteraciones en los niveles de Q, si Trx 1 o ATG4. No obstante, los resultados obtenidos son compatibles con la hipótesis de que la alteración de los niveles de Trx 1 en respuesta a niveles incrementados de Q, podría actuar sobre ATG4 llevando a cabo un procesamiento más eficiente de pro LC3 a LC3I.

    En lo que respecta al papel de los ácidos grasos como moduladores de la función mitocondrial y la ruta de autofagia en células Hepa 1.6, observamos que la adición de las emulsiones Lipoplus y ClinOleic incrementó en gran medida la acumulación de gotas lipídicas con respecto a las condiciones control, siendo más llamativo en el caso de ClinOleic. El hecho de que esta emulsión produzca mayor acumulación de gotas lipídicas puede ser una respuesta adaptativa frente a la lipotoxicidad, fenómeno de disfunción celular causado por la hiperlipidemia en tejidos no adiposos que puede causar la muerte celular y que está asociada principalmente a los SFA, debido a la imposibilidad de éstos de convertirse eficientemente en triglicéridos [72-75]. La co-suplementación con ácidos grasos insaturados puede prevenir este fenómeno. Por tanto, y dado que ClinOleic presenta un 62% de oleico (OA; MUFA) y un 12% de palmítico (PA; SFA) mientras que Lipoplus presenta sólo un 6% de PA [76], es posible que las células tratadas con ClinOleic incrementen la formación de acúmulos grasos para paliar la toxicidad del PA facilitado por el OA. Además de esta hipótesis, se ha descrito que los PUFA n-3 previenen la formación de reservas grasas [77, 78]. Posteriormente se analizaron los niveles de Mfn2, proteína mitocondrial que participa en las interacciones entre mitocondrias y el RE [79] y entre mitocondrias y gotas lipídicas a través de la perilipina 1 [80], que podrían favorecer el metabolismo lipídico. Nuestros resultados revelaron un incremento significativo en Mfn2 en respuesta al tratamiento con ambas emulsiones, especialmente con Lipoplus, lo que podría resultar en una mejora del procesamiento de los acúmulos grasos. En cuanto al estudio de la función mitocondrial en respuesta a las distintas emulsiones, no se observaron cambios significativos en las actividades enzimáticas de los complejos de la CTE, ni tampoco modificaciones en el OCR y el ECAR.

    Puesto que en nuestro grupo de investigación se había demostrado previamente que el tratamiento con las emulsiones lipídicas incrementó los niveles de Q en la línea celular de estudio [81], siendo este incremento más significativo en el caso de los PUFA, y dada la relación existente entre el Q y la mitocondria, se llevaron a cabo determinaciones de masa mitocondrial, que mostraron que sólo el tratamiento con Lipoplus la incrementaba significativamente con respecto al control. Se llevó a cabo, además, la determinación del nivel de proteínas relacionadas con la mitofagia para comprobar posibles correlaciones entre este proceso y la acumulación de mitocondrias. En este sentido, los niveles de PINK1 disminuyeron en presencia de Lipoplus con respecto a las condiciones control, tendiendo Parkin a incrementarse levemente, indicando que este tratamiento podría estar reduciendo el balance de recambio mitocondrial. Por otro lado, el tratamiento con ClinOleic incrementó significativamente los niveles de Parkin. En cuanto al análisis de subunidades de los complejos de la CTE, los resultados más llamativos indicaron que el tratamiento con Lipoplus produjo un incremento significativo en los niveles de complejo I y tendió a incrementar el complejo III con respecto a las condiciones control. Esto puede relacionarse con el hecho de que los PUFA, en mayor medida que los SFA o los MUFA, ejercen una inhibición parcial de los complejos I y III, que son los principales productores de O2·- mitocondrial, y es posible que las células incrementen la expresión de estos complejos como respuesta adaptativa a dicho evento [82]. Ello explicaría también el aumento significativo en la producción de O2·- mitocondrial en presencia de esta emulsión, que fue más discreto en presencia de ClinOleic. En cuanto a las ROS, el incremento más significativo se produjo a nivel de peróxidos dónde el tratamiento con ClinOleic incrementó dramáticamente sus niveles con respecto al resto de condiciones experimentales. Esto puede ser explicado debido a la lipotoxicidad inducida por los SFA presentes en la composición de esta emulsión, aunque también sugiere una mayor eficiencia de la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD2) (que cataliza la reacción de dismutación del O2·- a H2O2), de ahí que los niveles de O2·- observados con este tratamiento fueran menores que los encontrados en presencia de Lipoplus. El daño oxidativo en proteínas no se alteró en presencia de ninguna de las emulsiones; no obstante, el grado de peroxidación lipídica disminuyó en células tratadas con Lipoplus, tendiendo a ocurrir lo mismo con Lipofundina, mientras que ClinOleic incrementó estos niveles con respecto a las otras emulsiones. Estos resultados pueden explicarse teniendo en cuenta que las emulsiones ricas en PUFA incrementan en mayor medida los niveles de Q en esta línea celular, aumentando así la defensa antioxidante [81]. En cuanto a la ruta de autofagia, el tratamiento con ClinOleic incrementó los niveles de mTOR y fosfo mTOR, Beclina 1, ambas formas de LC3 (en presencia de Cq) y tendió a aumentar los niveles de p62 y sus formas ubiquitiniladas. No obstante, estos cambios no supusieron modificaciones del flujo autofágico, tal y como se determinó mediante ensayos de citometría. Estos resultados pueden indicar que los SFA presentes en la emulsión provocarían una detención en la ruta autofágica, posiblemente por la acción de Sirt3 y la cascada de señalización que media, que favorecería la actuación del complejo mTORC1 bloqueando la ruta [83]. El tratamiento con la emulsión rica en PUFA n-3 actuó principalmente en los últimos pasos de la ruta de autofagia incrementando ambas formas de LC3, aunque más llamativamente LC3II, lo que fue suficiente para incrementar el flujo autofágico. Los niveles de Q parecen estar relacionados con esta respuesta, ya que tratamientos combinados con Lipoplus+PABA en presencia y ausencia de Cq, disminuyeron los niveles de p62, así como los de la forma LC3I, disminuyendo también la dinámica de ambas proteínas en comparación con las alcanzadas con el tratamiento simple con Lipoplus. Esto puede indicar que el incremento en la síntesis endógena de Q producido por Lipoplus juega un papel importante a nivel del procesamiento de pro-LC3 a LC3I, ya que es en este punto donde observamos una caída más drástica en presencia del tratamiento combinado con PABA. Al analizar los niveles de estas proteínas en presencia de un suplemento de Q10 exógeno (+/-Cq), los resultados revelaron que p62 no cambió, que LC3I se incrementó con el suplemento en ausencia y presencia de Cq y que LC3II sólo aumentó en presencia del tratamiento simple. Estos resultados muestran que la suplementación con Q10 exógeno es capaz de recrear parte de los resultados obtenidos con Lipoplus a nivel de LC3I, lo que podría indicar o bien que el aporte de un suplemento rico en n-3 actúa a nivel de LC3II de forma parcialmente independiente al incremento en los niveles de Q produce, o bien que el Q sintetizado de forma endógena regulara de forma más eficiente el paso de LC3I a LC3II.

    En cuanto a las alteraciones ultraestructurales relacionadas con la ruta de autofagia en músculo esquelético en respuesta al envejecimiento, la restricción calórica y la grasa de la dieta, los resultados mostraron respuestas diferenciales en función de la zona de la fibra muscular analizada, intermiofibrilar (IMZ) o subsarcolémica (SSZ), encontrándose en la primera un mayor número de autofagosomas y en la segunda, sobre todo mitocondrias alteradas. Mientras que en la IMZ el tamaño de estas figuras tendió a decrecer en prácticamente todas las intervenciones a los 18 meses, el volumen ocupado por las mismas varió en función de la intervención concreta, destacándose una marcada disminución de este parámetro en animales alimentados con la dieta CR.Lard y algo más discreta en los alimentados con CR.Soy. Sin embargo, animales alimentados con la dieta CR.Fish experimentaron la misma respuesta que el grupo control: un incremento en el volumen de estas figuras asociado a la edad. Por su parte, el tamaño de estas figuras en la SSZ creció significativamente a los 6 meses de intervención en los animales sometidos a RC sin que se produjesen modificaciones a más largo plazo. No obstante, en el grupo control y en el alimentado con la dieta CR.Fish sí que se produjo un crecimiento en estas figuras en periodos largos de intervención (18 meses). En cuanto a los efectores de la ruta de autofagia determinados, se observó un aumento significativo de los niveles de Beclina 1 en respuesta al envejecimiento en animales control, mientras que la RC no indujo cambios en este parámetro, resultados que concuerdan con los hallados por otros autores [84]. Los niveles de p62 aumentaron drásticamente con el envejecimiento en los animales del grupo control, lo que podría poner de manifiesto un bloqueo en la ruta autofágica asociado a la edad, hecho que coincide con observaciones llevadas a cabo en músculo de ratas de avanzada edad [85]. En condiciones de RC se observó un incremento de p62 a los 6 meses de intervención, mientras que en intervenciones más largas estos niveles permanecieron invariables, siendo menores que los observados en el grupo control homólogo en edad. Estos resultados indican que la RC calórica puede desbloquear el flujo autofágico asociado al envejecimiento. El tipo de grasa aportada no indujo modificaciones significativas a nivel de este parámetro. La falta de cambios en la ratio de la proteína LC3 en respuesta a la edad en el grupo control indica que estas últimas etapas de la ruta no se ven afectadas por el envejecimiento, resultado que concuerda con otros estudios llevados a cabo en roedores [84, 86]. En condiciones de RC se observó una disminución de la ratio de LC3 a los 6 meses de intervención con respecto al grupo control homólogo en edad, niveles que se incrementaron en intervenciones más largas hasta alcanzar valores similares a los obtenidos en los animales control, por lo que no parece que la reducción en la ingesta esté favoreciendo un incremento significativo del flujo autofágico, al menos a nivel de las últimas etapas de la ruta. En cuanto a la grasa de la dieta suministrada, el dato más destacable es el aumento de la ratio de LC3 en animales alimentados con la CR.Fish a los 18 meses de intervención con respecto al resto de grupos sometidos a RC. Estos resultados son compatibles con estudios llevados a cabo en ratones Fat-1, donde un incremento en la cantidad de ácidos grasos n-3 indujo un incremento en la ruta de autofagia, aumentando la expresión de proteínas tales como LC3 [45]. Los marcadores de mitofagia PINK1 y Parkin no se alteraron en respuesta al envejecimiento, resultado que está en concordancia con diversos estudios llevados a cabo en otros modelos animales [87]. En condiciones de RC, los resultados más llamativos fueron los obtenidos con la dieta CR.Lard a los 6 meses de intervención, donde los niveles de PINK1 fueron los más elevados y los de Parkin los más bajos con respecto al resto de grupos de RC. A los 18 meses de intervención los animales alimentados con esta dieta mantuvieron unos niveles de PINK1 elevados y restablecieron los niveles de Parkin, por lo que un balance entre ambas proteínas puede determinar el papel de PINK1 como reguladora del proceso autofágico o como preservadora de la función mitocondrial [88].

    En cuanto al daño oxidativo en proteínas, se observó una tendencia a la disminución con el envejecimiento en animales control. Es posible que esta respuesta se deba a que los animales no presentan una edad muy avanzada, o a que la fracción proteica analizada (homogenados totales) no presente alteraciones, sin descartarse, por tanto, la posibilidad de daño en otras. No obstante, la RC disminuyó significativamente este parámetro a los 18 meses de intervención. En lo referente al componente graso aportado, en intervenciones largas todas las dietas disminuyeron el daño oxidativo con respecto a los 6 meses de intervención, siendo CR.Soy, dieta rica en PUFA de la serie n-6, la que presentó una mayor oxidación proteica. Por último, analizando los niveles de subunidades marcadoras de la CTE, los datos más llamativos en cuanto al impacto de la RC fueron la reducción en los niveles de complejo I a los 6 meses de intervención y la disminución también del complejo III a los 18 meses. Estos resultados pueden suponer una respuesta adaptativa de los animales sometidos a esta intervención por la que disminuyen la expresión de los dos complejos de la CTE que producen la mayor cantidad de ROS a nivel mitocondrial [89]. El componente graso de la dieta en condiciones de RC alteró la expresión de algunos complejos en animales jóvenes (II, III y IV). No obstante, esta respuesta quedó atenuada por el envejecimiento.

    Finalmente, atendiendo a las alteraciones ultraestructurales de la ruta de autofagia en hígado en respuesta al envejecimiento, la RC y la grasa de la dieta, se observó un aumento significativo en el tamaño de las figuras de autofagia en respuesta a la edad en todos los grupos experimentales, sometidos o no a RC. No obstante, en los grupos cuya ingesta calórica fue reducida, se observó una atenuación de esta respuesta, ya que a los 18 meses de intervención las figuras de autofagia presentaron un área menor, siendo el grupo CR.Soy 18 el que presentó las más pequeñas entre los homólogos de edad de las otras dietas. Podría entonces considerarse la posibilidad de que la RC prevenga el incremento de tamaño de las figuras de autofagia que se produce como consecuencia de la edad. Por su parte, el volumen de hepatocito ocupado por las mismas se incrementó significativamente con el envejecimiento en el grupo control y en el alimentado con la dieta CR.Fish, observándose una atenuación de esta respuesta en el resto de grupos sometidos a la intervención a largo plazo (18 meses). De forma global, los cambios en los parámetros analizados pueden indicar un flujo autofágico mejorado en intervenciones a largo plazo (18 meses). Aunque en RC todas las grasas parecen actuar de manera similar, la rica en PUFA de la serie n-3 parece ser menos eficiente en la modulación de estos parámetros a tiempo final del estudio, presentando no obstante algunas mejoras en periodos de intervención más cortos. Atendiendo a los efectores proteicos de la ruta autofágica, se observó un incremento de Beclina 1 asociado al envejecimiento en animales control, mientras que en los sometidos a RC este aumento ocurrió a los 6 meses, no observándose alteraciones posteriores. La grasa de la dieta afectó diferencialmente a este parámetro. En las dietas CR.Lard y CR.Fish esta proteína se incrementó en respuesta a la edad, mientras que en la CR.Soy esta respuesta se atenúo. Los niveles de p62 permanecieron invariables en el grupo control en función de la edad, mientras que en el grupo sometido a RC disminuyó significativamente a los 18 meses de intervención, no observándose cambios en intervenciones más cortas. Estos resultados concuerdan con los de otros autores donde periodos cortos de RC no indujeron cambios en esta proteína [54]. La grasa de la dieta no afectó de manera notable este parámetro, no obstante los niveles más elevados de p62 se encontraron en los animales alimentados con la dieta CR.Fish en ambos periodos de intervención. En estos animales el volumen de las figuras de autofagia era mayor a los 18 meses, lo que podría indicar que en este grupo el mayor volumen y tamaño de las figuras de autofagia podría deberse a su eliminación menos eficiente por la maquinaria lisosomal [90]. En referencia a LC3 no se produjeron alteraciones en la ratio de ambas formas en respuesta a la edad en animales control, hecho constatado por otros investigadores [91]. En condiciones de RC se incrementaron ambas formas de LC3, pero no su ratio, lo que podría indicar tanto un incremento del flujo autofágico como un bloqueo en el mismo. La grasa de la dieta actuó de manera diferencial a nivel de esta proteína, observándose un aumento significativo en la forma LC3II y una tendencia al aumento de la ratio en animales alimentados con CR.Lard, lo que puede suponer una mejora del flujo autofágico. En el caso de los animales alimentados con CR.Fish, el incremento en ambas formas de la proteína a los 18 meses de intervención es compatible con un bloqueo en las últimas etapas de la ruta que, a su vez, puede estar relacionado con el incremento de tamaño y volumen de las figuras de autofagia observadas bajo dicha intervención. Por su parte, los niveles de PINK1 no variaron en respuesta al envejecimiento en el grupo control ni tampoco en animales sometidos a RC. No obstante, a los 18 meses, el grupo alimentado con la dieta CR.Lard fue el que presentó los niveles más elevados de esta proteína, resultado compatible con un incremento en el proceso de recambio de mitocondrias.

    En cuanto al daño oxidativo a proteínas, no se observaron alteraciones asociadas a la edad, hecho que está en la línea de observaciones previas llevadas a cabo por nuestro grupo de investigación en las que el nivel de hidroperóxidos no se alteró con el envejecimiento en estos mismos animales [92]. Por su parte, el componente graso de la dieta sí que alteró estos niveles incrementándolos en los grupos alimentados con dietas ricas en PUFA frente a las ricas en SFA y MUFA, siendo CR.Fish la que presentó los niveles más elevados, lo que vuelve a coincidir con el estudio del nivel de hidroperóxidos previamente citado. Sin embargo, periodos más largos de RC fueron capaces de revertir este daño. Por último, en referencia a los niveles de las subunidades marcadoras de la CTE, los resultados más llamativos mostraron un incremento de los niveles de complejo I y una tendencia a la disminución en el complejo III. En condiciones de RC, a los 6 meses de intervención se produjo un descenso significativo de los niveles de expresión del complejo III, lo que podría representar una adaptación promovida por la RC disminuyendo la expresión de uno de los complejos que produce mayor cantidad de ROS a nivel mitocondrial, lo que contribuiría a una disminución en la producción de las mismas [54]. Este efecto, sin embargo, no se aplicaría al complejo I, cuya expresión aumenta de manera significativa en las mismas condiciones experimentales. Por su parte, a los 18 meses de intervención, la RC produjo un incremento generalizado en la expresión de las subunidades determinadas. La grasa de la dieta parece ejercer cambios muy sutiles a este nivel. El más destacable se produjo con la dieta CR.Lard, dónde se observó una disminución significativa del complejo III en respuesta a la edad con respecto al resto de grupos sometidos a RC, lo que, como comentamos anteriormente, podría suponer una adaptación de este grupo a disminuir la expresión de uno de los complejos que más ROS produce.

    3.Conclusión En la línea celular Tkpts, las subunidades de la cadena de transporte electrónico se regulan diferencialmente en función de la procedencia endógena o exógena del coenzima Q, siendo el complejo III el que más se afecta por los niveles de esta molécula. La función mitocondrial, determinada mediante el análisis de la ratio de consumo de oxígeno (OCR) y la ratio de acidificación del medio extracelular (ECAR), se ve afectada también por los niveles de coenzima Q, actuando el kaempferol de manera independiente a su acción como precursor biosintético de esta molécula. En cuanto a la generación de especies reactivas, los compuestos fenólicos son capaces de disminuir la producción de éstas a través de su acción como precursores biosintéticos del coenzima Q. No obstante, esta acción no es suficiente para llevar a cabo dicha respuesta. En esta línea celular, el proceso de dinámica mitocondrial no se ve afectado por las alteraciones en los niveles de coenzima Q que promueven las diferentes intervenciones. No obstante, el tratamiento con el polifenol kaempferol favorece los procesos de fisión mitocondrial de manera independiente a su actividad como precursor biosintético de Q. En lo referente al proceso autofágico, el procesamiento de la proteína LC3 a LC3I, uno de los últimos pasos de esta ruta, está modulado por la disponibilidad de coenzima Q con independencia de su origen endógeno o endógeno. Sin embargo, el aumento en los niveles de esta molécula resulta en una disminución en la acumulación de autofagosomas. En dicho efecto la actividad de la proteína ATG4 mediada por Trx 1, juega un papel clave 1.

    Atendiendo al otro modelo celular estudiado, la línea Hepa 1.6, la acumulación de gotas lipídicas, los niveles de subunidades de la cadena de transporte electrónico y el daño oxidativo, son procesos modulados por el tipo de ácido graso presente en el medio de cultivo. El incremento en los niveles de coenzima Q que produce el suplemento con ácidos grasos n-3, participa en la regulación de la autofagia que estas sustancias llevan a cabo, favoreciendo el procesamiento de LC3.

    En cuanto al estudio realizado en ratones sometidos a restricción calórica con diferente aporte graso, la máxima preservación de la autofagia con el envejecimiento en músculo esquelético se produjo en animales alimentados con la dieta de manteca frente al resto de grupos cuyo aporte graso fue aceite de pescado y soja. Además, el impacto de la restricción calórica sobre la abundancia de complejos mitocondriales fue pequeño, limitándose a la reducción del complejo I en animales jóvenes y el complejo III en animales viejos. El principal efecto de la grasa en estas condiciones de reducción de la ingesta, fue la alteración en la expresión de algunos complejos mitocondriales mediada por PUFA en animales jóvenes, atenuándose la respuesta con el envejecimiento.

    Finalmente, nuestros resultados en hígado muestran que la restricción calórica disminuye el tamaño y abundancia de las figuras de autofagia en intervenciones largas, actuando el componente graso de la dieta de manera similar. No obstante, fue la grasa rica en PUFA n-3 la menos eficiente en la modulación de estos parámetros, mostrando sin embargo algunas mejoras en periodos de intervención más cortos. En este mismo tejido, el daño oxidativo se alteró en respuesta al componente graso de la dieta según la predicción de su índice de dobles enlaces en animales jóvenes, atenuándose esta respuesta con la edad. En cuanto a los componentes de los complejos mitocondriales, éstos incrementaron su expresión con el envejecimiento en animales sometidos a restricción calórica, sin que la grasa de la dieta diera lugar a modificaciones ulteriores. Por último, recalcar que el efecto de las intervenciones nutricionales llevadas a cabo en los distintos parámetros analizados es específico de tejido (músculo vs. hígado), siendo también determinante la edad de los individuos.

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