Resumen de Estudio del hígado y líquido peritoneal en fases tempranas de ovejas infectadas experimentalmente con fasciola hepatica
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1. Introducción o motivación de la tesis:
El estudio para la caracterización de una vacuna eficaz frente al parásito Fasciola hepatica tiene gran importancia ante la necesidad de vías de tratamiento alternativo a la administración de tricabendazol, frente al cual se describen cada vez más casos de resistencia en animales frente a este medicamento (Brennan y cols., 2007; Molina-Hernández y cols., 2015). El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha sido realizar un estudio en fases tempranas de la infección (1, 3, 9 y 18 días post-infección, dpi) con F. hepatica en oveja, momentos en los que el parásito penetra a través del intestino y migra por la cavidad peritoneal para llegar al hígado, donde se instaura. De esta forma, se han evaluado muestras de líquido peritoneal y de hígado de ovejas tanto infectadas en fases tempranas como no infectadas y se ha realizado una caracterización proteómica, inmunocitoquímica y de expresión génica con muestras de líquido peritoneal y una caracterización inmunohistoquímica del hígado para conocer mejor la interacción entre el parásito y el hospedador (oveja) en estas fases tempranas de la infección. Los resultados podrían ser útiles para desarrollar en un futuro un tratamiento eficaz en forma de vacuna que pueda evitar la instauración del parásito a nivel hepático en el hospedador.
2. Contenido de la investigación: En la rata, se ha demostrado que la respuesta inmunitaria protectora ocurre durante los estadios tempranos tras la infección a nivel intestinal o peritoneal (Van Milligen y cols., 1998). Por tanto, el estudio de los mecanismos de respuesta inmunitaria durante la migración peritoneal resulta interesante para tratar de dilucidar posibles mecanismos efectores o mecanismos de inmunomodulación empleados por el parásito para evadir la respuesta del hospedador durante esta etapa de la infección y en el presente trabajo se realiza este estudio en la oveja, el cual es uno de los hospedadores naturales y definitivos que tiene el parásito F. hepatica.
Se llevaron a cabo dos experimentos (experimento 1 y experimento 2). En cada experimento se utilizaron 25 ovejas de 8 meses de edad de raza Merina las cuales fueron divididas en 5 grupos (n=5), cuatro de los cinco grupos se infectaron oralmente con una dosis de 150 metacercarias de F. hepatica. Estos grupos fueron eutanasiados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi). El quinto grupo se utilizó como grupo control no infectado y se sacrificó al final del experimento. Durante la necropsia, se realizaron lavados peritoneales de los animales inmediatamente después de los sacrificios para la recogida del líquido peritoneal y, posteriormente, se tomaron muestras de hígado.
Con el fin de evaluar la presencia de posibles biomarcadores en la infección temprana con F. hepatica, se realizó un estudio de proteómica con muestras del líquido peritoneal y de inmunohistoquímica con muestras de hígado. En el estudio proteómico del líquido peritoneal se identificaron proteínas relacionadas con la infección, incluyéndose diversas proteínas estructurales derivadas de la matriz extracelular hepática, relacionadas con el tejido conectivo y el epitelio, y proteínas relacionadas con el sistema inmunitario.
También se realizó el contaje absoluto y diferencial de leucocitos peritoneales, así como la caracterización de macrófagos y células dendríticas peritoneales mediante inmunocitoquímica, en el que se identificó que existe una polarización hacia un perfil M2 o alternativo de los macrófagos peritoneales desde el 1 dpi debido a la expresión del marcador CD206 en detrimento de la expresión del marcador iNOS.
El estudio de la expresión de citoquinas del líquido peritoneal mediante qRT-PCR de ovejas infectadas y no infectadas, determinó la presencia elevada de las citoquinas IL-10, IL-12, IL-13, IL-23 y TGF-β en ovejas a los 18 dpi, aunque sin diferencias significativas en comparación con los resultados del grupo control no infectado 3. Conclusiones:
1.- La cantidad de leucocitos peritoneales aumento a los 9 y 18 dpi en ovejas infectadas, principalmente debido al incremento de los eosinófilos, lo que sugiere que el parásito favorece el reclutamiento activo de leucocitos hacia el compartimento peritoneal compensando posibles pérdidas por los fenómenos de apoptosis inducidos por el parásito.
2.- Por otro lado, el aumento significativo en la expresión inmunocitoquímica del marcador CD206 desde el día 1 post-infección y la escasa variación en la expresión de iNOS sugieren una activación alternativa o M2 de los macrófagos peritoneales desde el primer dpi en ovejas infectadas por F. hepatica, lo que facilitaría la supervivencia del parásito durante su migración peritoneal y primeras fases de migración hepática.
3.- Los resultados de expresión génica detallan una ausencia de diferencias significativas de las citoquinas IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-23 y de los factores TGF-β, IFN-γ, TNF-α, iNOS y Arginasa, a los 18 dpi respecto al grupo control no infectado, lo que podría ser debida a la elevada variabilidad individual y a que la respuesta inmunitaria en peritoneo todavía no ha sido estimulada.
4.- En el análisis proteómico comparativo del líquido peritoneal de ovejas infectadas a los 18 dpi identificó un total de 176 proteínas, entre las que se encontraron proteínas estructurales derivadas de la matriz extracelular hepática, del tejido conectivo y del epitelio y proteínas relacionadas con el sistema inmunitario. Las proteínas periostina y la molécula de adhesión vascular-1 (VCAM-1) fueron las más abundantes en el líquido peritoneal de las ovejas infectadas con F. hepatica a los 18 dpi en comparación con el grupo control no infectado, lo que indica un incremento de la adhesión y migración leucocitaria hacia el compartimento peritoneal. La inmunolocalización en hígado de las proteínas periostina y VCAM-1 en el tejido hepático de las ovejas infectadas con F. hepatica a los 18 dpi, sugiere el posible origen hepático de la presencia de estas proteínas en el líquido peritoneal.
4. Bibliografía:
- Brennan, G.P., Fairweather, I., Trudgett, A., Hoey, E., McCoy, McConville, M., Meaney, M., Robinson, M., McFerran, N., Ryan, L., Lanusse, C., Mottier, L., Alvarez, L., Solana, H., Virkel, G., Brophy, P.M., 2007. Understanding triclabendazole resistance. Exp. Mol. Pathol. 82, 104-109.
- Molina-Hernández, V., Mulcahy, G., Pérez, J., Martínez-Moreno, Á., Donnelly, S., O’Neill, S.M., Dalton, J.P., Cwiklinski, K., 2015. Fasciola hepatica vaccine: We may not be there yet but we’re on the right road. Vet. Parasitol. 208, 101-111.
- Van Milligen, F.J., Cornelissen, Jan, B.W.J., Bokhout, B.A., 1999. Protection against Fasciola hepatica in the intestine is highly correlated with eosinophil and immunoglobulin G1 responses against newly excysted juveniles. Parasite Immunol. 21, 243-251.
