Resumen de Isolation, modeling and phytosome forms of antimicrobial and antiproliferative compounds from plectranthus spp.ectranthus spp
- español
Los productos naturales han sido una valiosa fuente de potenciales fármacos. Las plantas del género Plectranthus L'Her (Lamiaceae) poseen una amplia diversidad de usos etnomedicinales, que son una indicación de la presencia de potenciales fármacos en su composición. Los innovadores nanocarregadores de productos naturales, como el fitosoma, han demostrado ser una estrategia prometedora para la mejora de su veiculación y estabilidad.
En este trabajo, tres plantas del género Plectranthus fueron estudiadas: P. madagascariensis, P. neochilus y P. porcatus. Varios extractos fueron preparados por la combinación de métodos de extracción (infusión, decocción, maceración, microondas, ultrasonido o extracción con fluido supercrítico) utilizando disolventes de diferente polaridad (agua, acetona, metanol o dióxido de carbono supercrítico). Los extractos preparados fueron perfilados por HPLC-DAD y se identificaron los majores componentes principales, incluyendo polifenoles (ácido cafeico, ácido clorogénico y ácido rosmarínico), diterpenos (7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona y coleona U) y flavonas.
Los extractos preparados han sido evaluados por su actividad antimicrobiana (bacterias Gram positivas, Gram negativas, levaduras), antioxidante (captación de radicales por DPPH) y citotóxica (células MDA-MB-231). Los extractos de P. madagascariensis (maceracion y ultrasonido con acetona) y P. neochilus (ultrasonido com acetona) mostraron efectos antibacterianos contra Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis (bacterias Gram positivas) y Klebsiella pneumoniae (bacterias Gram negativas). Lo extracto de ultrasonido de P. madagascariensis obtenido con acetona reveló efectos antibacterianos potentes en Staphylococcus spp., incluyendo una cepa resistente a la meticilina, con valores de concentración mínima inhibitoria en el rango de 1,95 a 7,81 µg/mL. Esto está de acuerdo con los usos tradicionales de tales plantas como agentes anti-infecciosos. Cada extracto metanólico mostró potentes efectos antioxidantes en una concentración de extracto de 100 ng/mL (60,8-89,0%). El extracto de maceración de P. madagascariensis mostró algunos efectos citotóxicos en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 con IC50 de 64,52 mg/mL.
Dado que los extractos más bioactivos se obtuvieron de P. madagascariensis, aquellos se caracterizaron con más detalle con la identificación y cuantificación de los principales compuestos en los extractos. Cuatro compuestos fueron identificados por comparación con estándares: ácido rosmarínico, 7α,6β-dihidroxiroyleanona, 7αacetoxi-6β-hidroxiroileanona y coleona U. Se aisló un compuesto diterpénico del extracto ultrasonido de acetona de P. madagascariensis que se caracterizó por RMN 1H y 13C como 7α-formiloxi-6β-hidroxiroileanona. Esto supone el aislamiento por primera vez, de este compuesto en esta planta. Los efectos citotóxicos de los compuestos determinados en una batería de líneas celulares de cáncer y en conjugación con los datos disponibles de la literatura proporcionaron el establecimiento de algunas relaciones estructura-actividad de la estructura abietanica de la roilenanona. Se observó cierta selectividad para líneas celulares de cáncer de 7α,6β-dihidroxiroileanona y 7αacetoxi-6β-hidroxiroileanona con el índice de selectividad de 4,3 y 3,2 respectivamente.
El extracto más antibacteriano resultante del cribado inicial fue seleccionado para su incorporación en una formulación fitosomal y posteriormente recubierto por el quitosano. Los fitosomas obtenidos eran amorfos, uniformes en forma (SEM y AFM), con un tamaño medio de 1082 ± 363 nm y lo potencial zeta de 20,59 ± 12,02 mV. La eficiencia de encapsulación se determinó por HPLC (57,7 ± 0,06%). La interacción entre los componentes de la formulación se demostró mediante DSC y DRIFTS. Los fitosomas mostraron una liberación sostenida y el flujo de membrana de baja con una cierta mejora de la actividad anti-estafilococos (concentración mínima inhibitoria de 0,49 a 31,25 mg/ml). La seguridad de dicha formulación se demuestra in vitro por la baja citotoxicidad en queratinocitos humanos y in vivo con ensayos de irritación cutánea aguda y sub-crónica en ratones.
Este estudio demostró el potencial del género Plectranthus como fuente de nuevos agentes antibacterianos y de tratamiento del cáncer, justificándose algunos de los usos etnomedicinales de esas plantas. Los diterpenos del tipo abietano aislados a partir de P. madagascariensis poseen prometedores efectos citotóxicos selectivos contra algunas líneas de cáncer. Además, la formulación desarrollada de extracto de P. madagascariensis corresponde a un candidato antibacteriano tópico potente con un amplio espectro de actividad.
- English
Natural products have been used as a valuable source of new lead drugs. The Plectranthus L’Her (Lamiaceae) genus possess a wide diversity of ethnomedicinal uses which indicate the presence of bioactive molecules. Also, innovative methods for natural drug delivery, as phytosome, have showed to be a promising strategy for the improvement of delivery and stability.
In this work, three plants from the Plectranthus genus were studied: P. madagascariensis, P. neochilus and P. porcatus. Several extracts were prepared by the combination of extraction methods (infusion, decoction, microwave, ultrasound, maceration and supercritical fluid extraction) with different polarity solvents (water, acetone, methanol and scCO2). Those extracts were profiled by HPLC-DAD and the main components were identified, including polyphenols (caffeic acid, chlorogenic acid and rosmarinic acid), diterpenes (7α-acetoxy,6β-hydroxyroyleanone and coleon U) and flavones (rutina y naringenina).
The prepared extracts were screened for their antimicrobial (Gram positive and negative bacteria and yeasts), antioxidant (DPPH radical scavenging activity) and cytotoxic activities (MDA-MB-231 cell line). Extracts from P. madagascariensis (acetone maceration and acetone ultrasound) and P. neochilus (acetone ultrasound) showed antibacterial effects against Gram positive bacteria strains, namely, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and S. epidermidis and a Gram negative bacteria strain, Klebsiella pneumonia (MIC values 1.95-250 μg/mL). The ultrasound extract of P. madagascariensis prepared with acetone showed potent antibacterial effect against Staphylococcus spp., including a methicillin-resistant strain (MRSA), with MIC values ranging from 1.95 to 7.81 µg/mL. These results validate the traditional uses of such plants as anti-infectious agents. All methanolic extracts showed potent antioxidant effects at 100 ng/mL (60.8- 89.0%). The maceration acetone extract from P. madagascariensis showed moderate cytotoxic effects in the MDA-MB-231 breast cancer cell line with IC50 of 64.52 µg/mL. The organic solvent extracts from P. madagascariensis were the most bioactive and thus characterized (identification and quantification) using HPLC-DAD. Furthermore, the compounds were identified by authentic standard overlay: rosmarinic acid, 7α,6βdihydroxyroyleanone, 7α-acetoxy-6β-hydroxyroyleanone and coleon U. A diterpenic compound was isolated from the ultrasound acetonic extract of P. madagascariensis and spectroscopically characterized (1H- and 13C-NMR) as 7α-formyloxy-6βhydroxyroyleanone. This was the first time this compound was isolated from this plant.
The cytotoxic effect of the identified compounds was evaluated in a battery of cancer cell lines (MDA-MB-231, MCF-7, HCT116, NCI-H460 and MCR-5). The diterpenic compounds showed moderate to potent cytotoxicity in the majority of tested cell lines. A high selectivity for cancer cell lines was observed for 7α,6β-dihydroxyroyleanone and 7α-acetoxy-6β-hydroxyroyleanone with selectivity index of 4.3 and 3.2, respectively. The combination of the observed results and literature data afforded the establishment of new structure-activity relationships of roylenanone abietanic compounds. The relevance of lipophilicity and of the presence of an electron donating group at 6 and/or 7 positions was observed.
The antibacterial acetonic ultrasound extract from P. madagascariensis identified in the initial screening was selected for incorporation into a phytosomal formulation and subsequently coated by chitosan. Phytosomes were amorphous, uniform in shape as shown by AFM and SEM, and with an average size of 1082 ± 363 nm and zeta potential of +20.59 ± 12.02 mV. The encapsulation of the antibacterial extract was determined by HPLC (57.7±0.06%) and the chemical interactions between the formulation components was cofirmed by DSC and DRIFTS. Such phytosomes showed a sustained release of the extract 4 and lower skin-like permeation fluxes. An improvement up to a 4-fold factor in the anti-Staphylococci activity (MIC values 0.98-31.25 µg/mL) was observed. The safety of such formulation was verified by in vitro human keratinocytes cytotoxicity assays and by in vivo acute and sub-chronic dermal irritation tests in mice.
This study showed the potential of the Plectranthus genus as source of lead antibacterial and antiproliferative agents and validate the ethnomedicinal uses of the studied plants. The isolated abietane diterpenes obtained from P. madagascariensis possess promising selective cytotoxic effects, namely, aginst the lung cancer lines tested. Also, the developed formulation of extract of P. madagascariensis corresponds to a potent topical antibacterial candidate with a broad spectrum of activity.
- português
Os produtos naturais têm sido uma valiosa fonte de novos produtos farmacêuticos. As plantas de género Plectranthus L'Her (Lamiaceae) possuem uma ampla diversidade de usos etnomedicinais, que correspondem a uma indicação da presença de potenciais fármacos na sua composição. Métodos inovadores para a veiculação dos produtos naturais, como os fitossomas, demostraram ser uma estratégia promissora para a melhora da veiculação e estabilidade destes produtos.
Três plantas do género Plectranthus foram estudadas: P. madagascariensis, P. neochilus e P. porcatus. Extratos foram preparados pela conjugação de técnicas de extração como infusão, decocção, maceração, micro-ondas, ultrassons ou de extração por fluidos supercríticos, utilizando como solventes água, acetona, metanol ou dióxido de carbono supercrítico. Os extratos preparados foram perfilados por HPLC-DAD e identificados alguns dos principais componentes, por comparação com padrões, verificando-se na sua constituição polifenois, diterpenos e flavonoides.
Os mesmos extratos foram avaliados em termos das suas atividades antimicrobiana (bactérias de Gram positivo, Gram negativo e leveduras), antioxidante (captura de radicais) e citotóxica (células MDA-MB-231). Extratos de P. madagascariensis (maceração e ultrassons em acetona) e P. neochilus (ultrassons em acetona) apresentaram efeitos antibacterianos contra Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e Klebsiella pneumoniae. O extrato de ultrassons de P. madagascariensis obtido com acetona apresentou potentes efeitos antibacterianos em espécies de Staphylococcus, incluindo uma estirpe resistente à meticilina, verificando-se uma concentração mínima inibitória no intervalo de 1,95 a 7,81 µg/mL. Esta atividade encontra-se de acordo com os usos tradicionais destas plantas como agente antiinfecioso. Os extratos metanolicos apresentaram potentes efeitos antioxidantes a uma concentração de extrato de 100 ng/mL (60,8-89,0%). O extrato de maceração em acetona de P. madagascariensis apresentou alguns efeitos citotóxicos na linha celular de cancro de mama MDA-MB-231 com um IC50 de 64,52 mg/mL. Uma vez que os extratos mais bioativos foram obtidos a partir de P. madagascariensis, estes foram caracterizados em maior detalhe com identificação e quantificação dos principais compostos nesses extratos. Quatro compostos foram identificados por comparação com padrões: ácido rosmarinico, 7α,6β-dihidroxiroyleanona, 7α-acetoxi-6βhidroxiroileanona e coleona U. Um composto diterpenico foi isolado a partir do extrato de ultrassons com acetona de P. madagascariensis e caracterizado por RMN de 1H e 13C como 7α-formiloxi-6β-hidroxiroileanona. Este composto foi isolado pela primeira vez a partir desta planta. Os efeitos citotóxicos dos compostos purificados foram determinados numa bateria de linhas celulares de cancro e em conjugação com dados da literatura, foram estabelecidas algumas relações de estrutura-atividade na estrutura abietanica do tipo roileanona. Foi observada alguma seletividade para linhas celulares de cancro por parte da 7α,6β-dihidroxiroileanona e 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona com com índice de seletividade de 4,3 e 3,2 respetivamente.
O extrato com maior potência antibacteriana identificado na triagem inicial foi selecionado para sua incorporação numa formulação fitossomal com posterior encapsulação por quitosano. Os fitossomas obtidos apresentavam-se amorfos, uniformes na forma (SEM e AFM), com um tamanho médio de 1082 ± 363 nm e potencial zeta de 20,59 ± 12,02 mV. A eficiência de encapsulação determinada por HPLC (57,7 ± 0,06%). A existência de interações entre os componentes da formulação foi analisada por A ocorrência de encapsulação foi demonstrada por DSC e DRIFTS. Os fitossomas demonstraram uma libertação sustentada com redução da permeação trans-cutanea. Uma melhoria em até 4 vezes na atividade anti-estafilococo (concentração mínima inibitória de 0,49 a 31,25 mg/ml). A segurança desta formulação foi demonstrada por baixa citotoxicidade em queratinocitos humanos in vitro e por irritação negligenciável in vivo nos ensaios de irritação cutânea aguda e sub-crónica em ratinhos.
Este estudo demonstrou o potencial do género Plectranthus como fonte de novos agentes antibacterianos justificando-se alguns dos usos etnomedicinais destas plantas. Os diterpenos do tipo abietano isolados a partir de P. madagascariensis possuem efeitos citotóxicos com alguma seletividade face a algumas linhas celulares de cancro. A formulação desenvolvida a partir do extrato de P. madagascariensis corresponde a um promissor candidato a antibacteriano tópico com amplo espectro de atividade e elevada potência.
