Estudio sobre el control del número de dedos en la extremidad de los tetrápodos
- Autores: Rushikesh Sheth
- Directores de la Tesis: María Ángeles Ros Lasierra (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ginés Morata (presid.), Juan Mario Hurlé González (secret.), María Félix Bastida de la Calle (voc.), Miguel Torres Sánchez (voc.), James Sharpe (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Introducción En los vertebrados, el desarrollo de la extremidad comienza cuando las células mesodérmicas indiferenciadas de la capa somática del MPL se acumulan bajo el ectodermo de la pared lateral del cuerpo y la extremidad emerge como una pequeña protuberancia, el esbozo de extremidad, formado por células mesodérmicas recubiertas de una capa ectodérmica. El posterior desarrollo de la extremidad depende de una serie de interacciones recíprocas entre el ectodermo y el mesodermo (E-M) que son cruciales para la morfogénesis del esbozo de extremidad. Este proceso implica la formación de patrón, conjunto de procesos en el que las células indiferenciadas reciben información posicional y son especificadas, determinadas y posteriormente diferenciadas para formar una estructura. Esta información posicional se realiza a través de vías de señalización , mediadas por moléculas señalizadoras, que pueden ser agrupadas en cuatro grandes familias: la familia WNT, la familia de los FGFs, la familia HEDGEHOG y la superfamilia de los TGFs. La transducción de señal por estos ligandos depende de una serie de factores de transcripción, entre los que cabe destacar, por su importancia en el desarrollo de la extremidad, la familia de las proteínas GLI y la familia de las proteínas HOX.
Estudios embriológicos clásicos e investigaciones a nivel molecular han permitido identificar varios centros señalizadores u organizadores de la extremidad en desarrollo, que regulan y coordinan el crecimiento y la formación de patrón del esbozo de extremidad a lo largo de tres ejes, el eje P-D, el eje A-P y el eje D-V. Tres son los centros señalizadores más importantes. La cresta ectodérmica apical (AER), un engrosamiento del ectodermo en la parte más apical del esbozo de extremidad y que controla la formación de patrón en el eje P-D y cuya función está mediada por varios miembros de la familia de los FGFs. La zona de actividad polarizadora (ZPA), localizada en el mesodermo posterior del esbozo de extremidad y con función señalizadora en el eje A-P, mediada por la proteína SHH. El ectodermo no- AER que controla la formación de patrón en el eje D-V y en cuya función son fundamentales las señalizaciones por WNT y BMPs, miembros estos últimos de la superfamilia de los TGFs.
El esbozo de extremidad crece y se alarga a lo largo del P-D. Primero las células mesodérmicas se condensan y se diferencian a cartílago que, posteriormente es sustituido por hueso.
Se van formando progresivamente tres segmentos el proximal o estilopodio, el intermedio o zeugopodio y el distal o autopodio que contiene los elementos esqueléticos de la mano/pie.
Simultáneamente se va elaborando el patrón en los otros dos ejes, A-P y D-V. Se conocen muchos de los genes que regulan el crecimiento y la formación de patrón en estos tres ejes, pero no está claro como interactúan entre ellos.
Los genes HOX son una familia altamente conservada de factores de transcripción que controlan el desarrollo embrionario en todos los animales. Los mamíferos tienen 39 genes Hox organizados en cuatro clusters (HoxA, HoxB, HoxC y HoxD), cada uno conteniendo de 9 a 11 genes. Durante el desarrollo de la extremidad los clusters A y D desempeñan papeles fundamentales en la formación de patrón a lo largo de los tres ejes, aunque se ha estudiado más su papel en los ejes P-D y A-P. La especificación de los tres segmentos P-D está acompañada por un patrón específico de expresión de los genes 5'de los clusters A y D. Experimentos de pérdida de función en ratón han mostrado la existencia de una asociación entre determinadas proteínas HOX y cada uno de los segmentos próximo distales. Por ejemplo, parálogos del grupo 11 y parálogos del grupo 13 son absolutamente necesarios para la formación de patrón del zeugopodio y autopodio respectivamente. Los fenotipos de ratones mutantes con pérdida de función de alelos de los grupos 11, 12 y 13 pertenecientes a los cluster HOXA y HOXD, permite suponer que los 5'Hox están implicados en el control del número de dedos.
Por otro lado, trabajos recientes, han puesto de manifiesto la conexión entre los genes Hox y las vías señalizadoras más importantes para el desarrollo de la extremidad. Por ejemplo, se sabe que las proteínas HOX controlan la transcripción de Shh y que se unen físicamente a GLI3 (mediador de la actividad de SHH), y a SMADs (mediadores de la actividad de los BMPs) y modulan su actividad. Como señalamos anteriormente, el crecimiento y formación de patrón del esbozo de extremidad a lo largo de los ejes P-D y A-P está controlado por la señalización de los FGFs de la AER y por SHH de la ZPA respectivamente. Un bucle de retroalimentación positivo que se establece entre la AER-FGFs y ZPA-SHH es fundamental para este proceso y para el mantenimiento de los propios centros señalizadores. La pérdida de alguna señal lleva a la downregulación de la otras y también de los genes Hox y, como consecuencia, se para el desarrollo.
Por otro lado, en ausencia de los clusters HOXA y HOXD, no se activa la transcripción de Shh y AER-Fgfs están downregulados, por lo que es difícil conocer la función individual de cada uno de ellos.
Objetivos En esta tesis hemos tratado de profundizar en el conocimiento de la función de los genes Hox durante el desarrollo de la extremidad y, en particular, cómo estos factores de transcripción interactúan con las principales moléculas señalizadoras así como su papel en el control del número de dedos en la extremidad de los tetrápodos.
Resultados Para estudiar el papel de los genes 5'Hox en el crecimiento y formación de patrón del esbozo de extremidad, utilizamos el alelo mutante de Hoxa13 que interrumpe el Homeobox y por tanto conlleva pérdida de función y la triple deleción de Hoxd11-13. Mediante cruces de dobles heterozigotos obtuvimos toda la serie alélica de dobles mutantes en los que por hibridación in situ analizamos el patrón de expresión de los componentes fundamentales de las vías de señalización que regulan el desarrollo de la extremidad.
Nuestros resultados muestran que, en ausencia de Hoxa13 y Hoxd11-13, el dominio de expresión de Shh está reducido. Además Fgf10 y Grem1 se encuentran restringidos al mesodermo posterior sin que se observe su normal expansión anterior. El bucle Shh-Grem1-Fgf4, se ve alterado sin que el dominio de Grem1 se separe de la ZPA a nivel posterior ni de la AER a nivel distal. De acuerdo con los modelos actualmente aceptados, la duración del bucle se prolonga temporalmente en los dobles mutantes. Estos resultados indican indican la necesidad de los genes 5'Hox para la correcta terminación del bucle y, por tanto, para el tamaño final del esbozo de extremidad. Sin embargo, esta prolongación en el tiempo no está acompañada de un incremento del tamaño, más bien de una disminución, poniendo de manifiesto la implicación de los genes 5'Hox en la adecuada expansión del autopodio.
Nuestros resultados ponen en evidencia que los genes Hox no sólo actuarían upstream de las vías señalizadoras, puesto que son necesarios para el correcto establecimiento de las moléculas señalizadoras, si no también downstream de las mismas, probablemente interactuando con los mediadores intracelulares de las señales. Todo ello, sugiere la posibilidad de que, durante el desarrollo de la extremidad, las proteínas HOX puedan ser elementos fundamentales para la integración de todas las señales reguladoras.
El doble mutante Hoxa13 -/- ; HoxdDel(11-13)/Del(11-13) muere en mitad de la gestación sin formar dedos, similar al doble mutante Hoxa13-/-;Hoxd13-/ . Sin embargo, las alteraciones de expresión de los centros de señalización no son suficientes para explicar el fenotipo. En la búsqueda de una explicación para explicar dicho fenotipo, hemos analizado la expresión de Hoxa13-exon1 que nos demuestra la presencia de progenitores del autopodio. Estos progenitores son capaces de comenzar la diferenciación condrogénica como lo demuestra la expresión de Sox9 y Col2, sin embargo nunca se observan las condensaciones individuales de los dedos, indicando que los genes 5'Hox son fundamentales para este proceso.
Para valorar la posible alteración de la expresión de los genes Hoxa y Hoxd que permanecen en nuestro doble mutante, hemos analizado la expresión génica de Hoxd4, Hoxd9, Hoxd10 y Hoxa11. Nuestros resultados demuestran que la presencia de los productos 5'HOX en el segmento distal del esbozo de extremidad es necesaria para la correcta expresión espacial de los genes pertenecientes a los clusters HOXA y HOXD durante el desarrollo de la extremidad Para conocer el papel de los genes Hox en el control del número de dedos, analizamos los fenotipos resultantes de la pérdida de los genes 5'Hox, tanto en ausencia como en presencia de Gli3.
La eliminación de Hoxa13 o de Hoxd11-13 del ratón mutante de Gli3 aumenta la polidactilia típica de este mutante. Sorprendentemente, el mayor número de dedos hasta ahora conocido se forma en el mutante Gli3-/- ; HoxdDel(11-13)/Del(11-13) ; Hoxa13+/- , con una downregulación extrema de los genes 5'Hox. Los resultados observados después de la eliminación progresiva de los genes 5'Hox del mutante de Gli3 y vice versa nos indican que ambos genes 5'Hox y Gli3 regulan negativamente el número de dedos y lo hacen de una forma dependiente de la dosis.
Finalmente, nuestros resultados nos sugieren que la correcta expresión espacial y temporal de los genes Hox y un correcto balance entre las proteínas 5'HOX y GLI3R es necesario para la formación de patrón en el segmento distal del esbozo de extremidad y para que se establezca la pentadactilia típica de la extremidad de los tetrápodos.
