Epidemiología de legionella feeleii como agente causal de neumonía y diseño de nuevos métodos de diagnóstico
- Autores: Lucianna Rosalia Vaccaro Muñoz
- Directores de la Tesis: Soledad Fenoy Rodríguez (dir. tes.), Carolina Hurtado Marcos (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad CEU San Pablo ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Molina Martín (presid.), Esperanza Rodríguez de las Parras (secret.), Carmen del Águila de la Puente (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
El género Legionella está constituido por bacilos gram-negativos ubicuos en ecosistemas acuáticos (naturales y artificiales) y es ampliamente conocido por las epidemias de enfermedad respiratoria que produce anualmente en diferentes partes del mundo. La legionelosis está ubicada entre las primeras causas de neumonía severa en Estados Unidos y Europa, y se caracteriza por presentar una morbi-mortalidad significativa, principalmente en individuos de edad avanzada e inmunosuprimidos. Por ello, hoy en día, es una enfermedad de declaración obligatoria según la Organización Mundial de la Salud (OMS).
Existen más de 60 especies de Legionella aisladas de muestras ambientales, incluyendo las procedentes de las redes de abastecimiento de agua potable a las que está expuesta la población. Por tanto, resulta indispensable realizar un control epidemiológico de los posibles nichos ecológicos de estas bacterias como medida de prevención. Las especies más frecuentes en el agua son L. pneumophila, L. anisa, L. bonzemanii, L. feeleii y L. micdadei, también conocidas por producir infección en humanos. Actualmente, el método de diagnóstico utilizado en los hospitales para el diagnóstico de la enfermedad del legionario se basa en la detección de antígenos de la especie más patógena, L. pneumophila serogrupo 1, causante del 70 al 90 % de los casos a nivel mundial.
España es el tercer país con el mayor número de notificaciones de la enfermedad del legionario en Europa, con casi 1.000 casos anuales producidos por L. pneumophila serogrupo 1. En el ámbito ambiental destaca la aparición de las especies de L. no-pneumophila distribuidas en todo el territorio nacional, encontrando a L. feeleii como una de las bacterias más frecuentes en embalses y baños recreativos de la región central de España. Considerando esto, surgió el interés de conocer el alcance que puede tener esta bacteria como posible agente causal de neumonía en este país, así como su epidemiología ambiental y el riesgo que puede suponer su presencia en ecosistemas acuáticos a los que está expuesta la población. Para ello, se llevó a cabo el presente estudio piloto constituido por la recolección y procesamiento de muestras clínicas provenientes de pacientes con sintomatología pulmonar y de muestras ambientales de Estaciones de Tratamiento de Agua Potable (ETAPs) de la zona centro de España. Adicionalmente, se realizó un ensayo in vivo con ratones A/J para evaluar la patogenicidad de una cepa ambiental de L. feeleii aislada de aguas españolas. Paralelamente, se diseñaron unos cebadores para la amplificación parcial del gen mip (macrophage infectivity potentiator) de L. feeleii y con ellos se puso a punto una PCR convencional para lograr la detección específica de esta especie. También se utilizó una PCR semi-anidada basada en la determinación del gen ADNr 16S para la caracterización de las distintas especies de Legionella tanto en el ámbito clínico como ambiental.
La PCR convencional diseñada para la identificación de L. feeleii demostró ser una herramienta sensible y específica, capaz de detectar una concentración mínima de ADN de L. feeleii de 5 pg/μL. Además, puede ser utilizada para la amplificación simultánea de otras especies de L. no-pneumophila implicadas en patología humana y colonización ambiental como L. longbeachae, L. micdadei y L. dumoffii. En cuanto a la PCR semi-anidada (gen ADNr 16S), se confirmó su utilidad para la identificación de L. pneumophila y varias especies de L. no-pneumophila, siendo más sensible para la detección de L. anisa. Cabe destacar que ambas PCR fueron aplicadas en las diferentes etapas de este estudio clínico-ambiental obteniendo resultados satisfactorios, entre ellos la notificación de los primeros casos de la enfermedad del legionario producidos por L. feeleii y L. anisa en España.
Para el diagnóstico clínico se utilizaron las herramientas moleculares mencionadas anteriormente, la técnica de rutina hospitalaria (antigenuria por inmunocromatografía) y el método gold standard (aislamiento por cultivo en medio selectivo). Finalmente, se determinó una incidencia de legionelosis de 11,7 % en pacientes que acudieron a hospitales de Madrid capital durante septiembre 2013-diciembre 2014. El mayor número de casos se concentró entre otoño e invierno, en individuos mayores a 50 años y con predisposición en el género masculino. Los protocolos de PCR utilizados en este estudio mostraron ser más útiles en el diagnóstico de legionelosis, permitiendo el reconocimiento de un mayor número de casos en comparación a los métodos hospitalarios habituales. En la distribución de las especies se obtuvo que el 80,9 % de los casos positivos correspondieron a Legionella spp., seguido por un 15,9 % de L. pneumophila, y 3,2 % de los casos restantes fueron producidos por L. no-pneumophila (L. feeleii y L. anisa). Como se indicó previamente, las primeras infecciones por L. feeleii y L. anisa que se registran en España fueron diagnosticadas en este estudio a través de herramientas moleculares, resaltando que estos casos de legionelosis, al igual que los identificados como Legionella spp., pasaron desapercibidos en las técnicas de referencia (cultivo de muestras respiratorias e inmunocromatografía en orina).
La PCR convencional que se diseñó en el presente estudio para la determinación específica de ADN de L. feeleii también fue útil en las muestras ambientales, donde se encontró que la prevalencia de esta bacteria en las ETAPs estaba vinculada exclusivamente a la presencia de amebas de vida libre (AVL). La habilidad que tiene ésta y otras especies de Legionella de crecer en el interior de los protozoos es la clave para la persistencia y amplificación de las mismas en las ETAPs, siendo capaces de sobrevivir a los diferentes tratamientos utilizados en la potabilización del agua.
Respecto a la evaluación de una cepa ambiental de L. feeleii en ratones A/J, se observó que el sistema inmunológico de los animales fue capaz de controlar el crecimiento de esta bacteria a los 22 días post-inoculación, encontrando escasos signos histopatológicos de lo que pudo ser una posible estimulación antigénica ante la presencia de tejido linfoide asociado a bronquiolos (BALT) reactivo, observado en dosis de patogenicidad moderada (106 y 107 UFC/mL). En cuanto a la intubación endotraqueal, fue un procedimiento de pocas complicaciones por lo que puede recomendarse como método de inoculación para estudios posteriores.
