Resumen de Las proteínas stim1 - orai1 - trpc y la agregación plaquetaria en diabetes mellitus tipo 2
El ión Ca2+, mensajero intracelular utilizado por numerosas hormonas y neurotransmisores, constituye el sistema de señalización intracelular más ubico y con mayor numero de implicaciones fisiológicas y patológicas, entre las que se encuentran fenómenos de movilidad, contracción y secreción, diferenciación y replicación celular e incluso apoptosis y muerte celular. De aquí la importancia que tiene la homeostasis del Ca2+ en el correcto funcionamiento celular. Una gran parte del Ca2+ intracelular se encuentra almacenado en orgánulos citoplasmáticos que actúan como depósitos intracelulares de Ca2+. El almacenamiento del Ca2+ dentro de estos depósitos desempeña dos funciones importantes: por un lado constituye un mecanismo de regulación para el ión y por otro lado proporciona un potencial de liberación de Ca2+ durante señales fisiológicas en respuestas a agonistas fisiológicos.
Sabemos que la estimulación de plaquetas humanas con trombina induce una elevación de la concentración del Ca2+ libre citosólico ([Ca2+]c), debido a la liberación del ión desde los depósitos intracelulares por un lado, y a su entrada desde medio extracelular por otro lado. En la literatura científica hay descritos dos tipos de depósitos intracelulares diferentes en plaquetas humanas: el sistema tubular denso y los depósitos de Ca2+ de naturaleza acídica y de origen lisosomal. En primer lugar, hemos investigado la contribución de estos depósitos acídicos en la agregación plaquetaria inducida experimentalmente, y hemos comprobado como la agregación plaquetaria inducida por trombina se reduce cuando en el medio extracelular no hay Ca2+. Por otra parte, el tratamiento de plaquetas con 2,5-di-(tert-butyl)-1,4-hidroquinona (TBHQ), inhibidor selectivo de la Ca2+-ATPasa sarco-endoplámica (SERCA3) que provoca la descarga de los depósitos acídicos de Ca2+, reduce la agregación plaquetaria inducida por la trombina. Por otra parte, en presencia de TBHQ, la agregación plaquetaria inducida por los péptidos SFLLRN y AYPGKF, agonistas de los receptores PAR1 y PAR4 respectivamente, se reduce significativamente. En plaquetas con los depósitos acídicos de Ca2+ vaciados, la activación de la GPIb-IX-V con trombina resulta en una agregación de plaquetas reducida si el medio extracelular contiene 1 mmol/L de Ca2+, y en ausencia de agregación plaquetaria en un medio libre de Ca2+, respectivamente. Los resultados de este primer trabajo de esta memoria sugieren que la acumulación de Ca2+ en los depósitos acídicos es necesaria para la normal agregación plaquetaria inducida por la activación de los receptores de la trombina asociados a proteínas G, PAR-1 y PAR-4, y la ocupación de la glicoproteína GPIb-IX-V rica en leucina, y constituyen una evidencia del papel funcional de los depósitos de Ca2+ de naturaleza acídica y de origen lisosomal en plaquetas humanas (Amor NB, Zbidi H, Bouaziz A, Isaac J, Hernández-Cruz JM, Salido GM, Rosado JA, Bartegi A. Acidic-store depletion is required for human platelet aggregation. Blood Coagul Fibrinolysis. 20: 511-516, 2009).
Por otro lado, se conoce que STIM1 es el sensor de Ca2+ localizado en la membrana del retículo endoplásmico, pero su papel como sensor de la concentración intraluminal de Ca2+ en los depósitos acídicos no ha sido investigado. En un segundo trabajo, hemos mostrado que los sensores STIM1 y STIM2 se expresan en los orgánulos acídicos tipo lisosomal y en los gránulos densos, en plaquetas humanas, aislados por separación inmunomagnética. Nuestros resultados muestran que la depleción de los depósitos acídicos de Ca2+ mediante la bafilomicina A1, que es el inhibidor específico de la V-ATP-asa, aumenta la asociación entre STIM1 y STIM2, así como entre estas proteínas y el canal de la membrana plasmática Orai1. También que la depleción de estos depósitos acídicos de Ca2+ induce la co-inmunoprecipitación de STIM1 con proteínas TRPC, como la hTRPC1 y la hTRPC6, así como entre Orai1 y ambas proteínas TRPC, de una manera dependiente del tiempo. Además, los resultados muestran que la bafilomicina A1 aumenta la asociación entre STIM2 y SERCA3. Con estos resultados hemos demostrado la localización de STIM1 y STIM2 en los depósitos acídicos de Ca2+ y sus asociaciones con los canales de Ca2+ y las ATP-asas después del vaciamiento de los depósitos acídicos (Zbidi H, Jardin I, Woodard GE, Lopez JJ, Berna-Erro A, Salido GM, Rosado JA. STIM1 and STIM2 are located in the acidic Ca2+ stores and associates with Orai1 upon depletion of the acidic stores in human platelets. J Biol Chem. 286: 12257¿12270, 2011).
La diabetes mellitus es un síndrome frecuentemente asociado con varias complicaciones cardiovasculares, incluyendo micro y marcoangiopatias, que son la causa principal de mortalidad y morbilidad en estos pacientes. La disfunción plaquetaria que conduce a un estado protrombotico contribuye al desarrollo de las micro y macroangiopatias. Las plaquetas de pacientes diabéticos tipo 2 (DM2) muestran una elevada adhesividad y capacidad para agregarse más rápidamente que las plaquetas de sujetos sanos. Las anomalías en la señalización por Ca2+ se consideran causantes de las disfunciones plaquetarias descritas en la diabetes mellitas tipo 2. Las alteraciones de la homeostasis intracelular del Ca2+ incluyen una actividad atenuada de la Ca2+-ATPasa de membrana plasmática (PMCA) por fosforilación de la tirosina y expresión reducida, el funcionamiento del intercambiador Na+/Ca2+ en modo reverso y el aumento en la entrada de Ca2+. Por todo ello, nosotros hemos investigado la expresión de diferentes proteinas asociadas con la entrada de Ca2+, uno de los mayores eventos en la señalización por Ca2+ en plaquetas.
La selección de los donantes diabéticos la realizamos aleatoriamente entre pacientes normotensos y con unas concentraciones de Hb-glicosilada (HbA1c) superiores al 6%. Por otro lado, los sujetos controles sanos presentan unas concentraciones normales de HbA1c (3,5-5%). Hemos analizado la expresión de TRPC1, 3 y 6 por Western Blotting en donantes diabéticos y sanos. Los resultados muestran que la expresión de TRPC1 en plaquetas de donantes diabéticos o sanos es similar; sin embargo, la expresión de TRPC6 está reducida en plaquetas de pacientes DM2 en comparación con plaquetas de donantes sanos y, por otra parte, la expresión de TRPC3, Orai1, y STIM1 se encuentran aumentadas en pacientes DM2 comparados con los controles. Estos resultados suponen una explicación para la incrementada entrada de Ca2+ inducida por agonistas fisiológicos en plaquetas de pacientes DM2 (Zbidi H, Lopez JJ, Amor NB, Bartegi A, Salido GM, Rosado JA. Enhanced expression of STIM1/Orai1 and TRPC3 in platelets from patients with type 2 diabetes mellitus. Blood Cells Mol Dis. 43: 211-213, 2009). Sin embargo, en presencia de antagonistas específicos de los receptores purigénicos y serotogénicos, la entrada de Mn2+, inducida por la tapsigargina (TG), se vió reducida en plaquetas de donantes diabéticos comparados con los sujetos sanos. El tratamiento de las plaquetas con TG o con el agonista trombina aumento la co-inmunoprecipitación de STIM1 con Orai1, hTRPC1 y hTRPC6 en plaquetas de donantes sanos, una respuesta que fue significativamente más reducida en plaquetas de pacientes diabéticos. Nuestros resultados indican que la entrada de cationes divalentes operada por los depósitos está reducida en plaquetas de sujetos diabéticos tipo 2, que probablemente puede ser consecuencia de una alteración de la asociación de STIM1 con la subunidad del canal Orai1, hTRPC1 y hTRPC6, lo que podría estar implicado en la patogénesis de las respuestas reducidas y alteradas observadas en las plaquetas de pacientes diabéticos (Jardín I, López JJ, Zbidi H, Bartegi A, Salido GM, Rosado JA. Attenuated store-operated divalent cation entry and association between STIM1, Orai1, hTRPC1 and hTRPC6 in platelets from type 2 diabetic patients. Blood Cells Molecules and Diseases 46: 252-260, 2011).
