Relationship between apoptosis, capacitation and refrigeration of RAM espermatozoa and their influence on fertility
- Autores: Noelia Mendoza Magén
- Directores de la Tesis: Rosaura Pérez Pe (dir. tes.), María Teresa Muiño Blanco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Álvaro Sánchez Ferrer (presid.), María Pilar Coy Fuster (secret.), Ignacio Caballero Posadas (voc.), Maria Dolors Briz González (voc.), Patricia Grasa (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El uso de la inseminación artificial (IA) en cualquier especie animal requiere el mantenimiento del semen en condiciones no fisiológicas. En la especie ovina, la IA con dosis refrigeradas es más común que con dosis congeladas, debido a los extremadamente bajos resultados de fertilidad obtenidos con semen congelado, lo que está limitando en gran medida el desarrollo del sector. Esto se debe fundamentalmente a la mayor sensibilidad al frío de los espermatozoides ovinos en comparación con los de otras especies. El proceso de criopreservación induce una serie de daños celulares, que incluyen el daño del frío o cold-shock, la dilución de la muestra y el estrés osmótico. Entre los daños del frío se ha descrito una capacitación prematura o criocapacitación que daría lugar a una disminución de la fertilidad obtenida con esas dosis. Pero más recientemente, otra de las causas a las que se atribuye la baja fertilidad de las dosis seminales criopreservadas es la presencia de espermatozoides apoptóticos en dichas dosis. Por ello, el objetivo general de esta tesis fue el estudio de la relación existente entre refrigeración, capacitación y apoptosis, así como su influencia sobre la capacidad fecundante. El conocimiento profundo de los cambios originados por estos procesos es esencial para conseguir una mejora de los protocolos de conservación del semen que se traduzca en aumento de la capacidad fecundante.
Las características de la superficie espermática varían en función de un amplio conjunto de factores individuales, ambientales (variaciones estacionales), de manejo (régimen sexual) y referentes al estado funcional del espermatozoide (grado de madurez, capacitación y reacción acrosómica). No todos los espermatozoides que componen un eyaculado son homogéneos desde el punto de vista estructural y funcional, sino que presentan una mayor o menor heterogeneidad que se manifiesta, en una muestra seminal, por la existencia de varias subpoblaciones espermáticas y gracias a la cual se incrementaría la posibilidad de fecundar al ovocito. El análisis de estas subpoblaciones presentes en muestras criopreservadas y la posibilidad de usar aquellas con mejores parámetros de calidad espermática, incluyendo el estado de capacitación y el grado de apoptosis, podría mejorar los resultados de fertilidad obtenidos tras IA.
Por ello, el primer objetivo de esta Tesis se centró en la mejora de los protocolos de preparación de dosis seminales ovinas, comparando diferentes medios y tasas de dilución, aditivos y subpoblaciones espermáticas separadas por reparto en sistemas bifásicos,atendiendo principalmente al estado de capacitación y a los parámetros apoptóticos de los espermatozoides. Los resultados indican que la refrigeración y el calentamiento posterior a temperatura fisiológica dañan la membrana plasmática y el ADN de espermatozoides ovinos. La presencia de sacarosa y glucosa en el medio de dilución del semen permite reducir la inversión de fosfatidilserina, el daño en el ADN, la capacitación y el consumo de oxígeno. Además, esta dilución no afecta la heterogeneidad celular evaluada por distribución en contracorriente con centrifugación (CCCD) en sistemas acuosos de bifase. La puesta a punto de un nuevo protocolo para la recuperación de espermatozoides de las fracciones separadas por CCCD ha permitido, por primera vez, determinar la capacidad fecundante de las diferentes subpoblaciones espermáticas. Las fracciones de las cámaras centrales y derecha del diagrama presentaron las mayores tasas de unión a zona pelúcida (número de espermatozoides unidos por ovocito). La melatonina es un potente antioxidante y regulador del sistema reproductor. Los resultados indican que ejerce una acción directa sobre espermatozoides ovinos que es muy dependiente de la concentración, disminuyendo la capacitación a altas concentraciones (1 ¿M) y aumentando la capacitación, la fecundación in vitro y el desarrollo embrionario a bajas (100 pM).
Dado que en anteriores trabajos de nuestro grupo se demostró que las proteínas del plasma seminal (PPS) son capaces de proteger y reparar algunos daños producidos por el frío en la membrana del espermatozoide ovino (Colas et al., 2009; Perez-Pe et al., 2001b; Perez-Pe et al., 2002a), como segundo objetivo se planteó el estudio del efecto de las PPS frente a la capacitación prematura y apoptosis de espermatozoides ovinos, sufridas como consecuencia del proceso de refrigeración. Los resultados obtenidos indican que las PPS ejercen un efecto protector frente a la refrigeración y la inducción de apoptosis, disminuyendo el porcentaje de espermatozoides capacitados y que presentan marcadores apoptóticos, además de interferir con ambas vías apoptóticas (extrínseca e intrínseca). El papel de las PPS en la apoptosis se debe principalmente al efecto que ejercen sobre la activación de las caspasas, moléculas clave en este proceso.
La predicción de la calidad del semen es de gran importancia para la producción y la mejora ganadera. Dada la expansión del uso de la IA y el desarrollo de la Biotecnología Reproductiva, resulta de gran interés disponer de nuevos métodos para predecir la capacidad fecundante de las dosis seminales, tanto de semen fresco como congelado ya que los análisis rutinarios no lo permiten. Como la fertilización es un proceso que requiere varias ¿capacidades¿ espermáticas (motilidad progresiva, morfología normal, metabolismo energético activo, capacidad para desarrollar una motilidad hiperactiva, integridad estructural y funcional de la membrana, integridad de las enzimas asociadas con la fecundación, capacidad de penetración y transferencia óptima del material genético), es necesaria la combinación de distintas técnicas de análisis del semen y/o de funcionalidad espermática como herramienta predictiva de la fertilidad in vivo. Según Amann y col. (Amann et al., 1993b), cuantos más parámetros seminales sean evaluados, más preciso será el test de predicción. La inclusión de parámetros novedosos, como los marcadores de apoptosis, podría aumentar la capacidad predictiva. Así, el tercer objetivo planteado en esta Tesis fue mejorar la capacidad de predicción de la fertilidad de dosis seminales ovinas analizando la relación entre parámetros rutinarios y novedosos de funcionalidad espermática y fertilidad. Este estudio se hizo mediante IA en campo en colaboración con dos empresas del sector. Los resultados obtenidos muestran, por primera vez, diferencias en marcadores apoptóticos y consumo de oxígeno en semen ovino de ambas estaciones, reproductiva y no reproductiva. Se ha podido establecer una correlación significativa entre el daño en el ADN y la fertilidad en las granjas más distantes. Además se encontró un parámetro que correlacionó significativamente con la fertilidad, fecundidad y prolificidad obtenidas in vivo, llamado ¿Factor X¿ ya que sus aplicaciones están pendientes de patente.
