Resumen de Aplicación de técnicas de microscopía de fluorescencia y análisis de imagen en el análisis de la morfometría e integridad de membrana del espermatozoide
El objetivo general de esta tesis fue la aplicación de técnicas de microscopía de fluorescencia y análisis de imagen en el análisis de la morfometría e integridad de membrana plasmática del espermatozoide y el estudio de la posible relación de estos parámetros con la fertilidad en campo. En la primera parte de esta tesis se abordó el desarrollo de nuevos métodos CASMA (análisis de la morfometría espermática asistida por ordenador) para el estudio de la morfometría del núcleo espermático en artiodáctilos domésticos (ovino, caprino, vacuno y porcino). Para ello se recogieron muestras de 20 machos por cada especie y se analizó el efecto del secado, fijación y la especie sobre la morfometría del núcleo espermático teñido con Hoechst 33342. Las imágenes se procesaron con el software de análisis de imagen Image J. El procesado de las muestras (secado y fijación), tuvo un efecto significativo sobre los parámetros morfométricos, aunque menor del esperado. En la mayoría de los parámetros morfométricos (área, perímetro, longitud), el núcleo del espermatozoide de toro es el que presentó mayores dimensiones, mientras que el de macho cabrío fue el más pequeño en todos los casos. El espermatozoide de los pequeños rumiantes presentó una morfología espermática más homogénea dentro de un mismo eyaculado que en vacuno y porcino. Posteriormente se estudiaron las subpoblaciones morfométricas de espermatozoides en cada especie utilizando modelos estadísticos clúster en dos pasos. Se describieron cuatro subpoblaciones espermáticas en la especie bovina y tres en el resto de especies estudiadas, diferenciándose principalmente por el tamaño del núcleo espermático y la elongación en la especie bovina y porcina, por el tamaño en la ovina y por la longitud, anchura y elongación en la caprina. En la segunda parte de esta tesis se compararon diferentes combinaciones de fluorocromos utilizadas en el estudio de la integridad de membrana plasmática del espermatozoide en ovino. Para ello se recogieron muestras de semen de morueco para comparar la efectividad y precisión de diferentes combinaciones de fluorocromos (Naranja de acridina, AO, SYBR-14, diacetato de carboxifluoresceina, CFDA y Hoechst combinados con ioduro de propidio, IP) y se utilizó el software libre ImageJ para el análisis de las imágenes obtenidas. La proporción de espermatozoides con la membrana intacta fue mayor cuando se determinó con AO y SYBR-14 que con CFDA y Hoechst. Las combinaciones más eficientes fueron AO/IP y SYBR/IP, porque permitieron una evaluación directa de la viabilidad espermática sin la necesidad de incubar las muestras y obteniendo resultados fiables. Por último, se estudió la capacidad predictiva de la morfometría del núcleo espermático y la integridad de la membrana plasmática, entre otros parámetros, sobre la fertilidad de machos y eyaculados en la especie ovina. Para ello se realizaron tres estudios diferentes. En el primero se seleccionaron 8 moruecos, con valores extremos de fertilidad (4 de alta y 4 de baja) y se analizó durante 6 semanas consecutivas la calidad seminal de los mismos, observando claras diferencias entre ambos grupos en motilidad, integridad de la membrana plasmática, morfometría y fragmentación del ADN. En el segundo estudio se comparó la distribución de subpoblaciones cinéticas y morfométricas en los mismos 8 machos observando también diferencias en su distribución entre los machos de alta y baja fertilidad. En el último estudio se analizaron 139 eyaculados de 56 moruecos, que se destinaron a la inseminación de 1319 ovejas, en las que posteriormente se determinó la fertilidad al parto. De los parámetros de calidad seminal analizados, la integridad de la membrana plasmática y la velocidad curvilínea (VCL) mostraron capacidad predictiva, aunque limitada, sobre la fertilidad, mientras que los parámetros morfométricos o la distribución de las subpoblaciones no se relacionaron con la fertilidad.
