Resumen de Evaluación de los efectos de la exposición oral a aluminio a través de la dieta en ratones TG2576. Papel protector de la melatonina
Celeste Gisela di Paolo Pereyra
La Enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva, irreversible y de origen hasta ahora desconocido. Se caracteriza clínicamente por el deterioro de las funciones cognitivas y cambios conductuales que afectan a la autonomía de los pacientes de forma gradual hasta llegar a una pérdida total en último término de las funciones mentales (Lambert et al., 2009).
Las características de la AD son la deposición de péptidos β-amiloide (Aβ) formando placas, degeneración neurofibrilar y metabolismo anormal de los metales. El aumento de los niveles de Aβ y la evidencia de daño oxidativo son marcadores neuropatológicos tempranos de la AD (Matsubara et al., 2003, Guo et al., 2013, Wang et al., 2016, Shukla, 2017, Wang y Wang, 2017). La AD afecta actualmente al 5-7% de las personas de más de 65 años. Se calcula que en España hay unas 650.000 persones afectadas y teniendo en cuenta el envejecimiento progresivo de nuestra sociedad se prevé que el número se duplique o incluso triplique en los próximos años constituyendo un auténtico problema de Salud Pública de cara al futuro.
La hipótesis de la interacción de los metales con otros factores para causar la AD ha ido ganando importancia gracias a estudios en los que se han encontrado niveles de tres a cinco veces mayores de algunos metales (Cu, Fe, Zn, Al…) acumulados en el cerebro de pacientes de la AD y en concreto en las placas amiloideas, así como evidencias de alteraciones en la homeostasis de los metales en el cerebro que pueden estar contribuyendo a la AD (Domingo, 2006; Shcherbatykh y Carpenter, 2007; Duce y Bush, 2010; Akiyama et al., 2012; Roberts et al., 2012; Yokel, 2012b; Decker y Muñoz-Torrero, 2016). Los humanos estamos continuamente expuestos a Al que puede provenir de fuentes naturales como la erosión de suelos, el aire, el agua o los alimentos en concentraciones relativamente bajas o puede venir derivado de la actividad humana. Las fábricas de producción de Al (más de 300 en el mundo), la minería y la industria son fuentes de exposición a Al. Tenemos Al en la fabricación de papel, en la construcción, en la fabricación de explosivos, en las industrias farmacéuticas que lo utilizan como anti-transpirante, desodorante, en productos cosméticos, en vacunas y en medicamentos como los antiácidos. También se produce Al derivado de la ingeniería electrónica, del transporte, de la fabricación de utensilios para el hogar, electrodomésticos y materiales de embalaje (Yokel, 2000; ATSDR 2008; Yumoto et al., 2009; Walton, 2012a; Yokel, 2012a; Yokel, 2012b; Walton 2013; Exley y Vickers, 2014).
A pesar de todo esto, la mayor y más usual fuente de exposición a Al en la población general es la dieta, que aporta entre 3,5 y 10 mg de Al por día (Yokel, 2012a). El Al (presente en el suelo, el aire y el agua) se transfiere de forma natural a todas las plantas y animales que utilizamos como alimentos. No obstante, el Al es ampliamente utilizado por la industria alimentaria como aditivo; colorantes, agentes impulsores, anti aglomerantes, ajustadores de pH, etc… Es en esta forma en la que se da una mayor exposición a Al ya que la comida procesada aporta a la dieta alrededor de 400 mg de Al/ Kg de comida (WHO, 1989; Yokel y Florence, 2006; Arnich et al., 2012; Walton, 2012a; Fekete et al., 2013; Walton, 2013; Yokel, 2013).
La absorción del Al se incrementa al formar complejos como los maltonatos, ascorbatos, succinatos, lactatos o citratos. La formación del complejo Al citrato aumenta la absorción de Al de 5 a 10 veces en humanos y animales (Domingo et al., 1993; García et al., 2009; Walton, 2012b; Zhou et al., 2008). Esto sucede gracias a que el citrato mantiene un pH óptimo de absorción, forma un complejo de bajo peso molecular e incrementa la permeabilidad del mucus intestinal de forma que el complejo puede absorberse, traspasar las paredes del intestino y acceder al torrente sanguíneo (Domingo et al., 1993; Whitehead et al., 1997; Kawahara et al., 2001; Rodella et al.,2008; Walton, 2012a; Yokel, 2013; Di Paolo et al. , 2014a; Di Paolo et al. , 2014b; Wang et al., 2016). El inconveniente que genera esto, es que el ácido cítrico también es un componente muy común en la dieta. Lo ingerimos tanto de fuentes naturales como la fruta y la verdura así como de fuentes artificiales como los aditivos alimentarios donde es ampliamente utilizado (Golub y Keen, 1999; Yilmaz et al., 2012; Magaia et al., 2013).
Hasta ahora, la relación entre el Al y la AD continúa siendo contradictoria con resultados que la defienden mientras otros no han sido capaces de demostrarla. A pesar de ello, está ampliamente aceptado que el Al es un agente neurotóxico capaz de causar alteraciones cognitivas al entrar en el cerebro. Por tanto, se considera importante continuar avanzando hasta conocer los mecanismos por los que se produce la neurotoxicidad y poder así proponer nuevos mecanismos para frenarla.
En la actualidad todavía no contamos con medicamentos capaces de frenar o revertir los daños generados por la AD; lo único que podemos hacer es intentar prevenir la enfermedad, evitando en la medida de lo posible, los factores de riesgo conocidos y aprovechar los factores protectores que se van descubriendo. Entre ellos, una dieta como la Mediterránea con antioxidantes naturales, ácidos omega 3, fosfatos y vitaminas B6 y B12; un estilo de vida saludable con actividad física, que aumenta el riego sanguíneo y el metabolismo del cerebro y reduce la cantidad de lípidos en sangre o también realizar actividades intelectuales de cualquier tipo que ayudan a mantener el cerebro activo (Gulcin et al., 2003; Kuller et al., 2007; Antunes Wilhelm et al., 2013; Selvaraju et al., 2014; Decker y Muñoz-Torrero, 2016).
Se sigue trabajando para encontrar las causas que provocan la aparición de la AD así como los mecanismos y vías por las que se produce el daño con la intención de poder encontrar un tratamiento paliativo o curativo. Está generalmente aceptado, que la reducción de la formación de Aβ y la prevención del daño oxidativo son el objetivo terapéutico más importante de la AD. Son muchos los fármacos y substancias que se están probando en éste sentido. Agentes quelantes, antiinflamatorios, hipocolesterolemiantes, antioxidantes, vacunas, tratamientos hormonales e incluso tratamientos con células madre han sido propuestos como terapias para detener o reducir la disminución cognitiva causada e impedir así el progreso de esta enfermedad (Limson et al., 1998; Matsubara et al., 2003; Harrison et al. 2004; Kuller et al., 2007; Bubenik y Konturek, 2011; Baño et al., 2012; Flynn y Melov, 2013; Stumm C. et al., 2013; Liu et al., 2013; Hendrix et al., 2015; Mendivil-Perez et al., 2017).
El tratamiento con antioxidantes nos permitiría neutralizar los radicales libres y disminuir el daño oxidativo. El uso en concreto, de un antioxidante que se encuentra de forma natural en el organismo como puede ser la melatonina o N-acetil-5-metoxitriptamina (Mel) parece incluso más provechoso al facilitarse el traspaso de la BHE y de las membranas celulares para llegar al interior celular.
Actualmente, parece que la Mel puede inducir reducciones en la deposición de Aβ, inhibir el procesamiento amiloidogénico de AβPP por la estimulación de la α-secretasa con la consiguiente reducción tanto de la β- como de la γ-secretasas a nivel transcripcional. Además, la Mel parece mejorar la estructura de las mitocondrias que son orgánulos muy sensible al estrés oxidativo y que además están dañadas en la AD (O'Neal-Moffit et al., 2015, Rudnitskaya et al., 2015, Kandimalla et al., 2016, Prakash et al., 2017, Shukla et al., 2017).
Diversos estudios proponen el uso de la Mel como agente terapéutico en la prevención de enfermedades neurodegenerativas donde se dan procesos de generación de radicales libres como la enfermedad de Parkinson o la AD (Matsubara et al., 2003; Zatta et al., 2003; Quinn et al., 2005; Bubenik y Konturek, 2011; Baño Otalora et al., 2012; Antunes Wilhelm et al., 2013; Mendivil-Perez et al., 2017).
Basándonos en todo esto, la hipótesis de este trabajo ha sido: La melatonina es capaz de proteger al cerebro contra los daños bioquímicos y cognitivos ocasionados por la exposición crónica a aluminio en un modelo de ratón transgénico para la Enfermedad de Alzheimer.
El objetivo general de esta tesis ha sido evaluar los efectos tóxicos y neurotóxicos así como los cambios cognitivos y de conducta derivados de la exposición crónica a Al mediante la dieta en el modelo animal para la AD.
Como objetivos específicos tenemos: Evaluar la actividad motora general de los ratones Tg2576 a los 18 meses de edad después de haber sido expuestos crónicamente a una dosis de 1mg Al/ g de dieta/ día.
Evaluar los daños que puedan aparecer en la memoria, así como el posible efecto beneficioso de la Mel para amortiguar estos daños.
Determinar la concentración de Al y otros metales esenciales (Cu, Fe, Mn y Zn) en diferentes zonas encefálicas (hipocampo, córtex y cerebelo) así como en otros tejidos corporales (hígado, riñón, bazo y fémur).
Determinar si la Mel es capaz de modificar la homeostasis de dichos metales.
Evaluar si la Mel puede modificar la concentración de Aβ en córtex e hipocampo de los ratones Tg2576.
Analizar la supervivencia neuronal mediante el estudio de los niveles de Casp-3 y SOD2, para valorar el posible daño producido por el tratamiento con Al.
Determinar si la Mel muestra capacidad antiapoptótica Material y métodos:
En el presente estudio, se escogieron como modelo los ratones heterocigotos APPSWE o Tg2576 (Tg). La principal característica de este modelo es la sobre expresión el precursor de la proteína amiloide humana (APP) y la tendencia a que la proteína generada sea procesada por las β-secretasas y no por las α-secretasas. Esto genera altas cantidades de la proteína Aβ en su forma insoluble que se acumula en el cerebro y por ello son uno de los modelos más utilizados para el estudio de la amiloidosis tipo Alzheimer.
Estos ratones Tg2576 y sus correspondientes controles wild-type fueron expuestos mediante la dieta y durante 14 meses a: Al, melatonina y ácido cítrico así como a todas las posibles combinaciones entre ellos.
A los 17 meses de edad se evaluó el comportamiento de los animales mediante las pruebas de Campo Abierto (Open Field) y el Laberinto de agua de Morris (Morris Water Maze).
A los 18 meses de edad, se sacrificó a los animales y se determinaron las concentraciones de Al, Fe, Cu, Zn y Mn en diferentes tejidos: fémur, hígado, riñón y bazo al igual que en córtex, cerebelo e hipocampo mediante espectrometría de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS).
También se evaluó la cantidad de β-amiloide soluble e insoluble (Aβ1-40 y Aβ1-42 respectivamente) utilizando un ensayo ELISA en córtex e hipocampo de ratones Tg2576 (ya que los ratones wild-type no expresan esta proteína humana) y también los niveles de proteína de la principal caspasa proapoptótica (caspasa-3) y la proteína antiapoptótica SOD2 mediante un análisis de Western Blot del córtex e hipocampo de ratones wild-type y Tg2576.
Conclusiones:
La sobreexpresión del gen APP parece generar un aumento en la actividad general y dificulta el aprendizaje de los animales Tg2576 en comparación con la cepa wild-type.
El genotipo Tg no afecta a la retención de la tarea en el Laberinto de agua de Morris.
El tratamiento con AlCit provoca déficits de aprendizaje e impide la retención de la memoria a largo plazo en los ratones Tg2576. Sin embargo estos déficits mejoran cuando los animales son tratados con Mel (AlCitMel).
La mayor concentración de aluminio se encontró en hueso en los animales tratados con aluminio y citrato, tanto en los wild-type como en los Tg2576. En el caso del tejido cerebral, la mayor concentración de aluminio se encontró en el hipocampo de los animales tratados con aluminio y citrato, tanto en los wild-type como en los Tg2576. En los otros elementos evaluados (Cu, Fe, Mn y Zn) los efectos no fueron significativos.
La Mel no parece tener ningún efecto sobre la concentración de los metales estudiados (Al, Fe, Cu, Mn y Zn) en ninguno de los tejidos analizados (hipocampo, córtex y cerebelo, hígado, riñón, bazo y fémur).
A pesar de que no se apreció un efecto significativo del tratamiento con melatonina sobre la cantidad de Aβ en el córtex e hipocampo en ratones Tg2576, sí se observó que el grupo tratado con aluminio, citrato y melatonina mostró una acumulación de Aβ similar a la de sus respectivos controles.
Los animales Tg2576 mostraron menores niveles tanto de caspasa-3 como de SOD2 en córtex e hipocampo (aunque las diferencias solo fueron significativas para caspasa-3 y en hipocampo).
Los grupos tratados con aluminio y citrato mostraron los mayores niveles de caspasa-3 y SOD2 tanto en los grupos wild-type como en Tg2576, en comparación con el resto de grupos evaluados, a pesar de que las diferencias no fueron estadísticamente significativas.
La melatonina no produjo un efecto protector, estadísticamente significativo, en la reducción en los niveles de caspasa-3 y SOD2, aunque sí se observó una tendencia a disminuir la concentración de dichas proteínas en el grupo aluminio citrato más melatonina.
