Resumen de Caracterización del gen "gyrA" de "Streptococcus pneumoniae" y regulación de su expresión
El gen gyrA que codifica la subunidad A de la DNA girasa de S. Pneumoniae ha sido clonado mediante una estrategia basada en reacciones solapantes de PCR y análisis físico de la región cromosómica, habiéndose determinado la secuencia de nucleótidos de un fragmento de 2685 pb del cromosoma de la cepa R6 que incluye este gen. Un análisis filogenético ha demostrado identidades del 43 a 60% entre GyrA de S. Pneumoniae y otras proteínas GyrA y del 31 a 39% con otras proteínas ParC. Las secuencias de GyrA y ParC de S.pneumoniae mostraron un 39% de identidad. Las secuencias de GyrA y ParC de bacterias gram-positivas con bajo contenido en G+C, formaron grupos diferenciados. Estos datos apoyan las diferentes características de inhibición por Fluoroquinolonas de bacterías Gram-positivas y Gram-negativas. El promotor de gyrA consta de una región -35, similar a la secuencia consenso en E.coli para la subunidad 70 de la RNAP y de un región -10 extendida. La transcripción del gen se inicia a 6 pb del extremo 3' terminal de la región -10 extendida y a 30 pb del codon de iniciación de traducción. La región que contiene el promotor de gyrA tiene una curvatura intrínseca cuyo centro se localiza en el espaciador entre las regiones -35 y -10 del promotor. La curvatura parece actuar como un represor per se puesto que su presencia disminuye la eficiencia de transcripción. El promotor de gyrB tiene una región -35 homologa a la secuencia consenso, no presenta región -10 y el sitio de inicio de la transcripción se encuentra a 46 pb del codon de iniciación de traducción. La transcripción de gyrA y gyrB se produce a partir de promotores independientes, y es estimulada por la relajación del DNA, lo que se denomina respuesta RST (estimulación de la transcripción mediada por relajación). La respuesta RST del promotor de gyrA en S.pneumoniae depende de la curvatura intrínseca, según se deduce de experimentos de inhibición de la actividad de la girasa con novobiocina y ciprofloxacina y de la determinación de la actividad promotora en fusiones del promotor de gyrA y el gen cat. La respuesta RST del promotor de gyrA en E.coli no depende de la curvatura, sino de las regiones -35 y -10 del promotor, del sitido de inicio de la transcripción y de las primeras bases del transcrito, aunque para la función del promotor, tanto en E.coli como en S.pneumoniae, sólo se requiere la región -10Ext y la secuencia posterior. La diferente respuesta RST del promotor de gyrA de nuemococo en estas bacterias, podría deberse a la ausencia en E.coli de un posible represor característico de neumococo. Este represor, con mayor afinidad por DNA superenrollado que relajado, modificaría la curvatura intrínseca inhibiendo la transcripción. La respuesta RST del promotor de gyrB en S.pneumoniae, según se deduce de experimentos de inhibición con novobiocina y ciprofloxacina y de la determinación de la actividad promotora en fusiones del promotor de gyrB y del gen cat fue de 3 veces superior a la del promotor de gyrA con novobiocina, y de 2 veces superior con ciprofloxacina. La estimulación del promotor de gyrA con ciprofloxacina produjo efectivamente un aumento en el superenrollamiento negativo. Este efecto fue más pronunciado en un mutante para parC, que en la cepa silvestre, debido a la inhibición en la cepa silvestre de la actividad de relajación de la topo IV. La estimulación del promotor de gyrA con novobiocina produjuo asimismo un aumento en el superenrollamiento negativo. Este efecto no se observó en un mutante para gyrB resistente a esta droga
