Estudio de la prticipación de la endonucleasa dff40/cad en el proceso de fragmentación nuclear durante la muerte celular apoptótica en ausencia de degradación oligonucleosomal del ADN

• Autores: Victoria Iglesias Guimarais
• Directores de la Tesis: Víctor J. Yuste Mateos (dir. tes.), Joan Xavier Comella i Carnicé (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2011
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Abelardo López Rivas (presid.), José Ramon Bayascas Ramírez (secret.), Joan Seoane Suarez (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
    • Biología molecular
  • Psicología
    • Psicología de la vejez
      • Muerte
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• Resumen

  • De forma clásica se ha descrito la muerte celular de tipo apoptótica a través de la presencia de dos características: la morfología nuclear de tipo II, que implica condensación y fragmentación de la cromatina, y la degradación oligonucleosomal del ADN. En el presente trabajo hemos demostrado de forma exhaustiva que la morfología nuclear de tipo II puede ocurrir sin una aparente degradación del ADN en fragmentos oligonucleosomales. Así, el análisis de la muerte celular inducida por estaurosporina en un panel de líneas neuroblásticas humanas nos permitó detectar que las células SK-N-AS presentan una morfología nuclear de tipo II en ausencia de degradación del ADN a nivel oligonucleosomal. Esta dicotomía ocurre en un entorno celular en el cual se observa una correcta activación de caspasas que finaliza con la muerte de la célula. En este contexto, DFF40/CAD/CPAN, la endonucleasa responsable de la degradación oligonucleosomal del ADN durante la apoptosis celular, carece de mutaciones que puedan afectar a su función. Además, hemos establecido que la endonucleasa DFF40/CAD existente en las células SK-N-AS es la responsable de la morfología nuclear de tipo II observada tras el tratamiento con estaurosporina, requiriéndose para ello la activación de caspasas. Sin embargo, el defecto de las células SK-N-AS para fragmentar el ADN a nivel ologonucleosomal radica en los citosoles de las mismas y no en la cromatina, la cual es capaz de ser degradada en un sistema in vitro. No obstante, hemos logrado que las células SK-N-AS sean competentes para degradar el ADN en fragmentos oligonucleosomales forzando la activación de DFF40/CAD, ya sea mediante el uso de caspasa-3 recombinante en un sistema in vitro o a través de la expresión forzada de la endonucleasa in vivo. El análisis de la distribución subcelular de DFF40/CAD muestra una localización diferencial entre células SK-N-AS y células capaces de generar fragmentos oligonucleosomales del ADN. Estos datos nos indican que la distribución subcelular de DFF40/CAD determinaría las dos acciones de la endonucleasa durante la apoptosis: generación de la morfología nuclear apoptótica de forma única o concomitante con la degradación oligonucleosomal del ADN. Finalmente, hemos demostrado que la morfología nuclear observada en células SK-N-AS apoptóticas correlaciona con la degradación del ADN en simple hebra con extremos 3'-OH libres, mediada directamente por la acción endonucleasa de DFF40/CAD.

    La existencia de modelos biológicos como las células SK-N-AS constituye una herramienta de vital importancia para el estudio de la relevancia de la morfología nuclear apoptótica versus la frgamentación oligonucleosomal del ADN en procesos de mutación y amplificación génicas, e inestabilidad cromosómica.