Disección de la estructura secundaria in silico, in vitro e in vivo de RNAs viroidales nucleares y cloroplásticos
- Autores: María Amparo López Carrasco
- Directores de la Tesis: Ricardo Flores Pedauye (dir. tes.), José Miguel Mulet Salort (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat Politècnica de València ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Ángel Aranda Regules (presid.), Jesus Angel Sanchez Navarro (secret.), Cristina Romero López (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: RiuNet
- Resumen
Los viroides, pequeños RNAs circulares (246-401 nt) con un elevado contenido en estructura secundaria que hasta ahora sólo han sido detectados en plantas superiores, son los agentes infecciosos más simples de la escala biológica y no codifican proteína alguna. Por lo tanto, dependen de motivos de secuencia y estructura de su genoma para utilizar la maquinaria de transcripción, procesamiento y tráfico de sus huéspedes con el fin de ser replicados e invadirlos sistémicamente, llegando a producir enfermedades de importancia económica.
La estructura secundaria de los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) es en general de tipo varilla, mientras que presenta múltiples ramificaciones en algunos viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae). Estas conformaciones están sostenidas por datos mayoritariamente obtenidos in silico (con algoritmos que predicen la estructura secundaria con menor energía libre) e in vitro (por métodos biofísicos o bioquímicos).
La asunción de que la conformación de los RNAs viroidales in vitro es similar o incluso idéntica a la que adoptan in vivo es cuestionable debido a las diferentes condiciones iónicas utilizadas en los análisis in vitro con respecto a las existentes in planta, así como a las interacciones con proteínas u otros factores del huésped. Por ello, en la presente Tesis Doctoral se han estudiado las estructuras in vivo de tres viroides aplicando diferentes metodologías.
En el viroide latente de la berenjena (ELVd), aprovechando su gran variabilidad genética, se han rastreado covariaciones y mutaciones compensatorias en variantes naturales que confirmen o afinen in vivo las estructuras de las dos cadenas del viroide predichas in silico y las obtenidas in vitro mediante SHAPE (2'-hidroxilo analizada por extensión del cebador). Los resultados de las tres metodologías son consistentes entre sí para el ELVd (+) RNA y conducen a una conformación en varilla con una bifurcación en cada extremo. Esta estructura es similar pero no idéntica a la del ELVd (-) RNA, ya que su conformación presenta un motivo cruciforme central (confirmado in vivo por la presencia de covariaciones en el mismo) y, además, ambos RNAs muestran movilidades electroforéticas distintas en geles de poliacrilamida nativos. Los resultados in vitro para el ELVd (-) RNA fueron menos consistentes con los obtenidos in silico e in vivo.
Por otra parte, la alta acumulación de las formas monoméricas circulares (mc) positivas de los viroides del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) y del manchado solar del aguacate (ASBVd) en Nicotiana benthamiana y aguacate, respectivamente, ha permitido aplicar una modificación de la metodología SHAPE para determinar la estructura in vivo de ambos RNAs, facilitando su comparación directa con las estructuras previamente derivadas in vitro mediante la misma técnica, y las predichas in silico. Las estructuras in planta de los mc PSTVd (+) y mc ASBVd (+) RNAs son muy similares (pero no idénticas) a las observadas in silico y mediante SHAPE in vitro. Estos resultados aportan las primeras pruebas directas de que los RNAs circulares de dos viroides, uno nuclear y el otro cloroplástico, se encuentran en su contexto fisiológico mayoritariamente desnudos y no fuertemente asociados a proteínas del huésped. Sin embargo, hemos observado que la región central conservada del mc PSTVd (+) RNA, particularmente el bucle E implicado en replicación y otras funciones, muestra una menor reactividad SHAPE in vivo posiblemente debida a la interacción con una o más proteínas que medien dichas funciones o a cambios estructurales motivados por otros factores del hábitat natural. Dada la baja concentración en su huésped del mc ASBVd (-) RNA, su estructura únicamente se ha estudiado in silico y por SHAPE in vitro, conduciendo a una conformación de tipo varilla parecida a, pero no la misma que la del mc ASBVd (+) RNA, ya que la movilidad electroforética de los dos RNAs en geles nativos de poliacrilamida es ligeramente diferente.
