Epidemiología y control de la podredumbre parda del melocotón en postcosecha
- Autores: Carlos García Benítez
- Directores de la Tesis: Antonieta de Cal y Cortina (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Politécnica de Madrid ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Josep Usall Rodié (presid.), María Soledad Sacristán Benayas (secret.), Eduardo Antonio Espeso Fernández (voc.), Antonio de Vicente Moreno (voc.), Joan Segarra Bofarull (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología y Recursos Genéticos de Plantas y Microorganismos Asociados por la Universidad Politécnica de Madrid
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Archivo Digital UPM
- Resumen
La podredumbre parda es la principal enfermedad de la fruta de hueso que afecta a melocotones y nectarinas. Los agentes causales de la enfermedad en España son tres especies fúngicas del género Monilinia: M. fructicola (Winter) Honey, M. fructigena (Aderhold and Ruhland) y M. laxa (Aderhold and Ruhland) Honey. La enfermedad provoca pérdidas tanto durante la pre-cosecha, causando marchitez de yemas y flores y podredumbre de frutos, como durante la post-cosecha, donde la incidencia de la enfermedad tiene una mayor importancia y causa de media entre un 10 y un 30 % de podredumbre pudiendo alcanzar más del 80 % de pérdidas en aquellos años favorables al desarrollo de la enfermedad y en variedades tardías. La etiología, epidemiología y control de la enfermedad ha sido estudiado en profundidad durante la pre-cosecha, pero no durante la post-cosecha. El propósito de esta tesis ha sido el estudio de la podredumbre parda durante la post-cosecha incidiendo en el estudio de las infecciones latentes en este periodo, que son una de las causas principales de la enfermedad en post-cosecha.
La infección de la fruta comienza cuando las conidias germinan en la superficie de la fruta dando lugar a tubos germinativos y/o apresorios que luego penetran el fruto. Se sabe que la fruta se vuelve más susceptible a medida que madura, sin embargo la relación entre los procesos de infección, la madurez de la fruta y las condiciones ambientales no está bien definida. Por ello se investigó como afectaban a la formación de tubos germinativos y apresorios de M. fructicola y M. laxa: (a) extractos de piel de melocotón maduro e inmaduro, (b) diferentes temperaturas y (c) diferentes humedades relativas; prestando especial atención a las condiciones ambientales presentes durante la post-cosecha. Se encontró que el mayor número de tubos germinativos se producía al incubar M. laxa o M. fructicola en medios de cultivo que contenían extractos de piel de melocotón maduro. Mientras que el mayor número de apresorios aparecía al incubarlos en medios de cultivo que contenían extractos de piel de melocotón inmaduro. Las conidias de M. laxa germinaron mejor que las de M. fructiola a bajas temperaturas. La formación de tubos germinativos y apresorios por Monilinia spp. se vio influenciada por los procesos de post-cosecha. M. laxa formaba un mayor número de tubos germinativos que M. fructicola cuando las conidias se incubaron a 100 % de humedad relativa en las condiciones de post-cosecha, este número aumentaba tras 3 días consecutivos de refrigeración. El número de apresorios formados por M. fructicola y por M. laxa también aumentaba tras 3 días consecutivos de refrigeración. La germinación tanto de M. fructicola como de M. laxa durante las condiciones de post-cosecha a 60 % de humedad relativa fue insignificante. Se concluye que las diferentes capacidades de germinación y formación de apresorios de M. fructicola y M. laxa a bajas temperaturas, confieren a M. laxa una ventaja competitiva sobre M. fructicola durante la refrigeración y almacenamiento en post-cosecha.
Tras la germinación de las conidias, Monilinia spp. penetra la superficie del fruto y coloniza los tejidos del mismo, la mayoría de los hongos necrótrofos se ayudan de fitotoxinas y/o enzimas líticas para facilitar estos procesos. Existe muy poca información sobre las enzimas líticas de Monilinia y ninguna sobre sus fitotoxinas, por lo que se decidió identificar y caracterizar las fitotoxinas y enzimas líticas producidas por las tres especies de Monilinia. Se detectó actividad fitotóxica sobre círculos de nectarina en los extractos con butanol del zumo de nectarinas infectadas con M. fructicola, M. fructigena o M. laxa y también en el extracto con acetato de etilo del zumo de nectarinas infectadas con M. fructicola. Los extractos con actividad fitotóxica se fraccionaron mediante HPLC para delimitar las moléculas fitotóxicas observando que únicamente una de las fracciones (tiempo de retención de entre 3,5 y 4,5 min) tenía actividad fitotóxica sobre círculos de nectarina. Al analizar los metabolitos fitotóxicos entre esos tiempos de retención con un espectrómetro de masas, se determino que tenían un peso molecular comprendido entre 329 y 387 g mol-1. Las tres especies de Monilinia presentaron actividad enzimática de α-glucosidasas, pectin-liasas, polygalacturonasas, proteasas y xilanasas en medio de cultivo. Adicionalmente, M. fructicola y M. laxa presentaron actividad enzimática de cutinasas en medio de cultivo. Ninguna de las especies tenía actividad enzimática de β-glucosidasas, necesaria para degradar hemicelulosa y callosa en medio de cultivo. Se concluye que Monilinia spp. utiliza tanto fitotoxinas como enzimas líticas para penetrar y colonizar los frutos.
Tras la penetración de la superficie de los frutos se sabe que el micelio de Monilinia coloniza los tejidos del fruto. Sin embargo, no existe mucha información histológica acerca de cómo se produce esta colonización tanto en infecciones visibles como en infecciones latentes de M. fructicola. Por ello se estudió la microanatomía de nectarinas con infecciones latentes y visibles causadas por M. fructicola. Para estudiar las infecciones visibles se incubaron nectarinas maduras inoculadas a 25 ºC durante 0, 24, 48, 72 y 96 h en oscuridad. Para estudiar infecciones latentes se incubaron nectarinas maduras inoculadas primero a 25 ºC durante 24 h y después, tras una desinfección superficial, a 4 ºC durante 72, 144, 218 y 288 h en oscuridad. Al terminar los distintos periodos de incubación se diseccionaron muestras de tejidos de las zonas de inoculación para su examen con el microscopio óptico de campo claro y con el microscopio electrónico de transmisión. No se observaron síntomas superficiales en los frutos con infecciones latentes durante las 288 horas de incubación. Durante la infección latente M. fructicola primero colonizaba las cavidades subestomáticas y después se expande colonizando lateralmente las células subepidérmicas y causando un colapso progresivo de las células epidérmicas sin extenderse al mesocarpo. En nectarinas con infección visible aparecían síntomas de podredumbre parda tras 24 h de incubación y a las 48 horas las capas superiores de células epidérmicas empezaban a colapsarse. Tras lo cual la enfermedad progresaba mostrando (a) colonización inter e intracelular de células epidérmicas y mesocárpicas con hifas finas y gruesas, (b) colapso y rotura de células epidérmicas y mesocarpicas, (c) aparición de cavidades lisogénicas en las células del mesocarpo, (d) degradación de la cutícula y la epidermis, y (e) esporulación de M. fructicola. Es de especial interés haber demostrado que las infecciones latentes de Monilinia permanecen activas, dado que se produce una colonización lenta y progresiva de las células subcuticulares.
Para llevar a cabo una buena estrategia de control es necesario conocer la incidencia de podredumbre parda en precosecha, el riesgo de infección en los 30 días previos a la cosecha, los tratamientos de control aplicados en ese periodo, así como la incidencia de infecciones latentes en los frutos recogidos. Todos lo anterior se puede obtener de manera rápida y sencilla, salvo la incidencia de infecciones latentes. El método de congelación durante la noche (ONFIT por sus siglas en inglés Overnight Freezing Incubation Technique) es el más utilizado para detectar infecciones latentes de podredumbre parda, pero se requieren de 7 a 9 días para su detección. Para resolver este problema se aplicó un método basado en qPCR con objeto de (i) detectar infecciones latentes de podredumbre parda en flores y frutos de nectarino e (ii) identificar las especies de Monilinia en dichas infecciones. Para aplicar este método se produjeron infecciones latentes de forma artificial en flores y frutos de nectarino con 10 aislados de M. fructicola, 8 aislados de M. fructigena y 10 aislados de M. laxa. Las flores con infecciones latentes artificiales causadas por M. fructicola tenían mayor concentración de ADN fúngico que las que se infectaron con M. fructigena y M .laxa. Sin embargo había mayor concentración de ADN en el mesocarpo de frutos con infecciones latentes artificiales causadas por M. laxa que en aquellos en los que éstas estaban causadas por M. fructicola. En conclusión el método basado en qPCR era más sensible, fidedigno y rápido que el método ONFIT para la detección de infecciones latentes de podredumbre parda, lo que muestra su utilidad para la detección temprana del patógeno, tanto para su aplicación en estrategias de control como para la detección de las distintas especies de Monilinia en los países donde alguna de ellas sea un patógeno de cuarentena.
Para asegurar la reproducibilidad del método de detección de infecciones latentes mediante qPCR, se llevó a cabo un ensayo internacional colaborativo. En este ensayo se determinó la sensibilidad y especificidad del método qPCR de detección de pequeñas concentraciones de ADN (infecciones latentes) en diferentes termocicladores de tiempo real, en 5 laboratorios diferentes y con una metodología común. La validación incluyó un análisis de la precisión, especificidad analítica, sensibilidad analítica y reproducibilidad, de acuerdo a las definiciones de la Organización Europea de Protección de Plantas (EPPO) PM7/98. Todos los equipos de qPCR detectaron infecciones latentes y muestras de micelio de Monilinia con las dos sondas hidrolíticas (que distinguen entre M .fructicola y M. fructigena/M. laxa), mientras que las muestras de flores y frutos sanos no fueron detectadas. La especificidad del método fue consistente entre los distintos laboratorios, pese a los diferentes equipos, sin que ningún laboratorio obtuviese valores “z” en la zona inaceptable. Las muestras de infecciones latentes causadas por M. fructicola fueron correctamente detectadas por todos los laboratorios, pero en algunas de las causadas por M .laxa se produjó detección cruzada como si se tratase de muestras de M. fructicola. La detección cruzada de M. laxa se pudo compensar mediante la implementación de un paso de discriminación alélica, lo que permite diferenciar entre muestras de M. fructicola y de M. laxa. En conclusión, el ensayo colaborativo demostró la robustez del método y confirmó los resultados obtenidos en la validación propia. Por lo que el método puede usarse para detectar infecciones latentes en flores y frutos asintomáticos de nectarino. Sin embargo, es necesario seguir trabajando en los cebadores y sondas del método para evitar las detecciones cruzadas.
Los tratamientos de control durante la post-cosecha están muy restringidos debido a la normativa Europea. Además, se desconoce el efecto que tienen sobre las infecciones latentes los tratamientos químicos, físicos y biológicos aplicados durante la post-cosecha. Por ello se decidió estudiar e identificar los puntos críticos de activación o favorecimiento de las infecciones latentes durante el proceso de post-cosecha. Para ello, nectarinas desinfectadas superficialmente y congeladas durante 48 h a -20 ºC se sometieron a varias combinaciones de: (a) volcado en agua (si o no), (b) duración del almacenamiento en frío a 4 ºC (0, 1 o 3 días antes del volcado y 0, 3 o 10 días después del volcado) y (c) humedad relativa (75 o 100 %). La activación de las infecciones latentes se produce durante los primeros 9 días cuando las nectarinas se incuban a 25 ºC. Tanto el volcado en agua como la duración del almacenamiento en frío influenciaron la activación de las infecciones latentes, mientras que la humedad relativa no tuvo ningún efecto sobre ella. La activación de las infecciones latentes causadas por Monilinia se vio reducida por el volcado en agua y cuando la duración combinada del almacenamiento en frío fue inferior a 11 días. Las combinaciones de post-cosecha afectaron a las infecciones latentes causadas por M. fructicola y por M. laxa en la misma medida. Se concluye que tanto el volcado en agua, como el acortamiento del almacenamiento en frío de los frutos son factores clave para limitar la incidencia de las infecciones latentes durante la post-cosecha.
