Resumen de Mecanismos neurobiológicos implicados en la preferencia de plaza a morfina y en la aversión a naloxona: papel de los receptores de CRF1
OBJETIVOS Diferentes estudios anatómicos, funcionales y de comportamiento sugieren un papel para los sistemas de CRF en los procesos adictivos. Con el fin de buscar dianas terapéuticas que pudieran ser de utilidad para el tratamiento de las adicciones el principal objetivo de este estudio se ha centrado en investigar la implicación de los sistemas de CRF y de los receptores de CRF1 en los efectos reforzantes positivos y negativos de la adicción a morfina, y en los cambios celulares y moleculares observados en diferentes estructuras cerebrales relacionadas con los sistemas de recompensa, los circuitos del estrés y la memoria. Para ello, utilizamos ratones genéticamente modificados en los cuales el CRF1R ha sido borrado (knockdown, KO) y ratones tratados con un antagonista selectivo de los receptores de CRF1. Como modelos de comportamiento utilizamos la preferencia condicionada de plaza (CPP) y la aversión condicionada de plaza (CPA), paradigmas de condicionamiento pauloviano en los que las propiedades reforzantes o aversivas de un fármaco, inicialmente relacionadas con un estímulo ambiental neutro, originan a lo largo del condicionamiento que este estímulo ambiental adquiera propiedades motivacionales, bien de atracción o aversión, cuando el animal es posteriormente expuesto.
METODOLOGÍA Se han empleado modelos de comportamiento animal basados en los patrones de dependencia y abstinencia a opioides. Se han empleado muestras de ratones Swiss y ratones modificados genéticamente carentes del receptor de CRF1 para evaluar la implicación del mismo en el proceso adictivo. Así, una vez obtenidas las muestras de tejido cerebral o cardiaco se han evaluado mediante inmunocitoquímica, inmunofluorescencia y westernblot las alteraciones en diferentes proteínas o factores de expresión génica como la tioredoxina, CREB, c-fos, enzimas como la tirosina hydroxilasa o mediadores como la protein kinasa A. Además, mediante HPLC se han analizado los cambios en las concentraciones de dopamina y noradrenalina. Mediante radioinmunoensayo se han analizado variaciones en hornomas como la ACTH y la corticoesterona. Finalmente, los datos fueron tratados estadísticamente con el software GraphPrism y SPSS 19.
CONCLUSIONES 1. El aumento de la actividad (co-localización CRF/CREB) de las neuronas de CRF en el PVN, CeA and BNST no se evidenció en animales condicionados a morfina fuera de las cajas de comportamiento lo que nos permite afirmar que las señales asociadas al consumo son las que inducen un aumento de las vías de CRF en el sistema cerebral del estrés, apoyando la idea de que el entorno donde se consume las drogas tiene una importancia fundamental en el tratamiento de la adicción.
2. CP-154,526, abolió la preferencia de plaza observada con morfina así como el aumento de CREB en PVN y DG. Además, la expresión de tioredoxina 1 y la co-localización PCREB/tioredoxina fueron antagonizados en presencia de CP-154,526 en el DG. Por tanto, las vías de CRF a traves de la activación del receptor de CRF1 están claramente implicadas en los procesos adictivos, concretamente en los efectos reforzantes positivos y en la asociación de la recompensa a la droga con el entorno donde se consume. 3. La delección genética de los receptores de CRF1 abolió los efectos aversivos, evaluados mediante el paradigma de CPA, del síndrome de abstinencia. La activación de las neuronas de TH fosforilada en serina 40 ó 31 en el NTS observada después del paradigma de CPA no fue abolida en animales KO del receptor de CRF1 mientras que el estímulo de las neuronas noradrenérgicas en el área VLM fue suprimido. Estos resultados demuestran que los receptores de CRF1 estarían implicados en los efectos aversivos del síndrome de abstinencia y que estos receptores modularían la activación de algunas de las vías noradrenérgicas bulbares que podrían ser responsables de la sintomatología negativa de la abstinencia.
4. Los efectos aversivos del síndrome de abstinencia a morfina están modulados por la activación del eje HPA, con un claro aumento de las concentraciones plasmáticas de ACTH. Además, este aumento retorno a niveles basales tras la extinción de los efectos aversivos, lo que claramente indica la participación del sistema cerebral del estrés hipotalámico en el mantenimiento de la memoria aversiva. La delección genética del receptor de CRF1 abolió los efectos aversivos y el aumento de las concentraciones plasmáticas de ACTH, lo que indica la implicación de estos receptores. La extinción de la memoria aversiva fue más rápida en las hembras que en los machos lo que demuestra distintos patrones adictivos en hombres y mujeres lo que puede tener importancia en el tratamiento clínico de las adicciones.
5. La activación de los receptores de CRF1 está implicada en los cambios adaptativos cardiacos que se producen en tejido cardiaco (aumento del turnover de NA, expresión de TH y PKA) y en las áreas cerebrales (PVN: aumento del turnover de NA; VLM: activación de neuronas de TH) que controlan la función cardiaca. Estos resultados sugieren que las vías de CRF a través de la activación de receptores de CRF1 podrían contribuir al establecimiento de las enfermedades cardiacas asociadas a los procesos adictivos.
AIMS Different anatomical, functional and behavioral studies suggest a role for the CRF systems in the addictive processes. In order to find therapeutic targets that could be useful for the treatment of addictions, the main objective of this study was focused on investigating the involvement of CRF systems and the CRF1 receptor in the positive and negative reinforcing effects of morphine addiction, and on cellular and molecular changes observed in different brain structures involved in reward systems, circuits of memory and stress. Here, we use genetically modified mice, in which the CRF1R has been deleted (knockdown, KO), and mice treated with a selective antagonist of the CRF1 mice. As addiction models, we used the conditioned place preference (CPP) and the conditioned place aversion (CPA), both paradigms of Pavlovian conditioning in which the reinforcing or aversive properties of a drug, first related to a neutral environmental stimuli, cause to conditioning throughout this environmental stimulus acquires motivational properties of either attraction or aversion, when the animal is subsequently exposed METHODS We have used models based on animal behavior patterns of dependence and opioid withdrawal. Tissue samples have been used from Swiss mice and genetically modified mice lacking CRF1 receptor to evaluate their involvement in the addictive process. Thus, once the samples of brain or cardiac tissue were obtained, we evaluated by immunocytochemistry, immunofluorescence and Western blot alterations in different proteins or gene expression as thioredoxin, CREB, c-fos, enzymes such as tyrosine hydroxylase or mediators as protein kinase A. In addition, we analyzed the changes in concentrations of dopamine and noradrenaline by using HPLC as well as alterations in hormones such as ACTH and corticosterone using radioinmmunoassay. Finally, the data were treated statistically with GraphPrism and SPSS 19 software.
CONCLUSIONS 1. CRF neurons located in the PVN and their projections to the NTS-A2 and VTA regulate the reinforcing effects of morphine showed by using the CPP paradigm. The increased activity (co-location CRF / CREB) of CRF neurons in the PVN, CeA and BNST was not evident in animals conditioned to morphine in their home-cages. Therefore, the signals associated with the consumption induce an increase of the CRF pathways in the brain system stress, supporting the idea that the environment where the drugs are consumed plays a key role in the treatment of addiction.
2. CP-154.526, a selective antagonist of CRF 1 receptors, abolished the CPP acquisition to morphine and the increased expression of CREB in the PVN and DG, an area considered important for memory storage of associated contexts and experiences. Furthermore, the expression of thioredoxin 1, a redox protein capable of phosphorylating CREB, and the co-localization of pCREB / thioredoxin were antagonized in the presence of CP-154.526 in the DG. These results demonstrate that CRF pathways, through the CRF1 receptor activation, are clearly involved in addictive processes, particularly, in the positive reinforcing effects (reward) and the association of drug reward with the environment.
3. The genetic deletion of the CRF1 receptor abolished the aversive effects of the withdrawal syndrome, as assessed by the CPA paradigm. Activation of TH neurons phosphorylated at serine 40 or 31 in the NTS-A2 observed after CPA paradigm was not abolished in KO animals for the CRF1 receptor, while activation of the noradrenergic neurons was suppressed in the area VLM. These results demonstrate that CRF1 receptors are implicated in the aversive effects of withdrawal and modulate the activation of some of the bulbar noradrenergic pathways which could be responsible of the negative symptoms of withdrawal.
4. The aversive effects of morphine withdrawal syndrome are modulated by the activation of the HPA axis, with a clear increase in plasma concentrations of ACTH. Moreover, this increase return to baseline levels after the extinction of the aversive effects, which clearly indicates the involvement of hypothalamic brain stress system in the maintenance of aversive memory. Genetic deletion of the CRF1 receptor abolished the aversive effects and the increased plasma ACTH concentrations, indicating the involvement of these receptors. The extinction of aversive memory was faster in females than in males demonstrating different addictive patterns in men and women which may be important in the clinical treatment of addictions.
5. Activation of CRF1 is involved in cardiac adaptive changes that occur in heart tissue (abolished the increase of NA turnover, TH expression and PKA) and the brain areas (PVN: abolished the increase of NA turnover; VLM: abolished TH activation of neurons) that control heart function. These results suggest that CRF pathways, through the CRF1 receptor activation, may contribute to the development of cardiac diseases associated with addictive process.
