Objetivos Estudiar el curso temporal de muerte de los fotorreceptores y la respuesta de las células de macro y microglia en el inicio de la degeneración de la retina, en dos modelos animales de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con diferentes mecanismos: la rata P23H-1 y la rata Royal College of Surgeons (RCS).
Estudiar la población de células ganglionares de la retina intrínsecamente sensibles a la luz que expresan melanopsina (mCGRs) en uno de los modelos de degeneración hereditaria de fotorreceptores: la rata P23H-1.
Investigar la respuesta de las células de macro y microglia de la retina de la rata adulta tras una o varias inyecciones intravítreas (IIV).
Material y métodos.
Para estudiar la evolución de la degeneración de la retina se utilizaron dos modelos de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con paradigmas diferentes, la rata P23H-1 y la RCS, y como controles sanos la rata Sprague Dawley (SD) y la Pieval Virol Glaxo (PVG), respectivamente. Los animales fueron procesados entre los 10 y 60 días de edad y se realizaron secciones transversales en criostato de sus retinas. Las secciones fueron inmunodetectadas con anticuerpos contra; i) rodopsina para detectar los segmentos externos de los bastones, ii) Opsinas L/M y S para detectar los segmentos externos de los conos, iii) molécula ionizadora adaptadora de enlace de calcio1 (Iba1) para detectar las células de microglia, iv) proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para detectar las células de macroglia , v) antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) para detectar células en división celular, vi) isolectina B4 (IB4) para detectar las células de microglia y vasos sanguíneos. Además, se cuantificaron las filas de núcleos de los fotorreceptores en la capa nuclear externa y las células de microglía en todas las capas de la retina.
Para estudiar la población de mCGRs en las ratas P23H-1 y P23H-3 se utilizaron animales con 30, 365 y 540 días de edad y como control se utilizaron ratas SD con la misma edad. Tras diseccionar y montar a plano las retinas, éstas se inmunodetectaron con anticuerpos contra melanopsina y/o Brn3a para detectar la población de mCGR y la población general de células ganglionares de la retina (CGR), respectivamente. Finalmente, se cuantificaron dichas poblaciones y se representó gráficamente su distribución en la retina mediante el uso de mapas de isodensidad para las CGRs y mapas de vecinos para las mCGRs. Además, de estas últimas se analizó su arborización dendrítica.
Para investigar la respuesta de las células de macro y microglia tras una o varias IIV se utilizaron ratas hembra adultas SD. Estas recibieron una o tres IIV (una cada 7 días) de anticuerpo anti VEGF derata (5 ?l, 0,015 ?g / ?l), triamcinolona (2,5 o 5 ?l, 40 ?g / ?L, Trigón Depot), bevacizumab (5 ?L y 25 ?g / µL, Avastin), o sus vehículos (PBS y solución salina equilibrada (BSS)). Las retinas se analizaron 7 días después de la última inyección, se montaron a plano y se incubaron con anticuerpos contra: i) Iba1, ii) GFAP y iii) vimentina (marcador específico de las células de Müller). Las células de macro y microglia fueron analizadas cualitativamente, además las células de microglia fueron analizadas cuantitativamente mediante un método semiautomático.
En todos los estudios las retinas fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia. En el estudio de las IIV también se utilizó además microscopía confocal.
Resultados.
Al analizar las retinas en los animales con degeneración retiniana, se observó que la degeneración de los fotorreceptores comenzaba antes y progresaba más rápidamente en las ratas P23H-1 que en las ratas RCS. Sin embargo, en ambos modelos de degeneración, la activación de las células de microglía ocurría simultáneamente a la muerte de los fotorreceptores; mientras que la sobreexpresión de GFAP en los astrocitos y células de Müller, comenzaba más tarde y con mayor intensida en estas últimas. A medida que progresaba la degeneración, en contraste con los animales sanos, encontramos células microgliales en las capas nuclear externa y de los segmentos externos de los fotorreceptores. Además, el número de células microgliales aumentó en la totalidad de la retina, pero disminuyendo en la retina interna y aumentando en la retina externa. Tanto el número total de células de microglia como la migración de las mismas desde las capas internas hacia las externas fue mayor en las ratas RCS. El mayor número de células microgliales en las retinas degeneradas no se puede explicar solamente con la migración intrarretiniana y además la inmunodeteccion de PCNA reveló proliferación microglial en ambos modelos, aunque más importantemente en las ratas RCS.
Cuando se analizó la población de mRGCs y de CGRs en las ratas P23H-1 jovenes comparadas con los animales controles se observó una disminución significativa en las CGRs que expresan Brn3a, pero no de mRGCs. Sin embargo, en las ratas P23H-1 adultas se observó una disminución del número de mRGCs y de CGRs de un 22.6% y un 28,2% a los 365 y 540 días de edad, respectivamente. Además, con el tiempo se observó una disminución en los parámetros de arborización dendrítica de las mRGCs tanto en las ratas P23H-1 como en las ratas P23H-3 (cepa en la que la degeneración de la retina es más lenta).
Al analizar la coexpresión de Brn3a y melanopsina en las ratas P23H-1 se encontró un porcentaje significativamente superior de coexpresión de ambos marcadores ya a 30 días de edad (3.31%) con respecto a los animales control (0.27%), además, este porcentaje de coexpresión aumentaba con la edad en las ratas P23H-1 (10,65% a 540 días de edad). Estos cambios celulares y de expresión se observaron solamente en los animales con degeneración hereditaria de los fotorreceptores (P23H-1), ya que en las ratas SD no se observó ningún cambio en la población general de CGR, ni en las población de mRGCs, ni en el porcentaje que mostró coexpresión (0.27%).
Finalmente, en las retinas tratadas con las IIV se encontró en la zona de la inyección y a lo largo de toda la retina una importante respuesta de las células de macro y microglia, sin importar la sustancia inyectada; y esta respuesta fue mayor en las retinas que habían recibido varias inyecciones. También se observó una leve respuesta de las células de microglia tras las IIV en las retinas contalaterales que no habían sido inyectadas. Cuando se inyectó el anticuerpo humanizado bevacizumab, este causó una reacción/respuesta microglial tan fuerte que no se pudieron cuantificar las células de microglia.
Al analizar la respuesta de las células de macroglia a las IIV se observaron dos tipos de respuesta: hipertrofia astrocítica e hipertrofia de los pies de las células de Müller. La hipertrofia de los astrocitos se observó en toda la superficie de las retinas inyectadas, mientras que la hipertrofia de los pies de las células de Müller sólo se observó en zonas bien definidas de la retina tras las inyecciones de triamcinolona y/o tras inyecciones repetidas.
Conclusiones.
En las degeneraciones hereditarias de los fotorreceptores la degeneración de la retina tiene un patrón diferente dependiendo del mecanismo etiopatogenico. En los dos modelos estudiados, la activación y migración de las células de microglia es simultánea a la muerte de los fotorreceptores, mientras que la respuesta de las células de macroglia es más tardía. La respuesta de la microglia no se puede explicar solamente en base a la muerte de los fotorreceptores ya que en los dos modelos existe una muerte severa de los fotorreceptores pero la respuesta de la microglia es mayor en las ratas RCS. Por lo tanto, en las ratas RCS la inflamación retininana es mayor y probablemente respondería mejor a un tratamiento antinflamatorio dirigido a la inhibición de las células de microglia.
Tras la degeneración de los fotorreceptores hay una perdida secundaria de la población general de CGRs y de mCGRs. Las mCGRs supervivientes mostraron parámetros de arborización dendrítica disminuidos y aumento de la coexpresión de Brn3a y melanopsina. Estos cambios fenotípicos y moleculares pueden representar un esfuerzo de las mCGRs capaces de expresar Brn3a para resistir a la degeneración y / o supervivencia preferencial de las mCGRs.
Las inyecciones intravítreas causan una respuesta en las células de macro y microglia que varía dependiendo de las sustancias inyectadas y del número de inyecciones. A mayor número de inyecciones mayor respuesta. Además la respuesta inflamatoria de la glía puede influir en los efectos de las sustancias inyectadas en la retina.
Purpose.
To study the temporal course of photoreceptor cell death and macro and microglial reactivity in two rat models of retinal degeneration with different etiologies: the P23H- 1 and the Royal College of Surgeons (RCS) rat strains.
To study the population of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (melanopsin-expressing RGCs, m+RGCs) in a rat model of inherited photoreceptor degeneration: theP23H-1 strain.
To investigate the macro and microglial response of the normal rat retina after one or several intravitreal injections.
Material y methods.
To study the evolution of degeneration in two models of inherited retinal degeneration, we have used the P23H-1 and Royal College of Surgeon rat strains, and control age-matched animals: Sprague Dawley (SD) for the P23H1 rats and Pieval Virol Glaxo (PVG) for the RCS rats. The animals were sacrificed at different postnatal ages (P) (from P10 to P60), and their retinas were cryostat cross-sectioned. Sections were immunodetected with antibodies against: i) rhodopsin to label the rod outer segment, ii) L/M and S opsin to label the cone outer segments, iii) ionized calcium-binding adapter molecule1 (Iba1) to label microglial cells, iv) glial fibrillary acid protein (GFAP) to label macroglial cells, v) proliferating cell nuclear antigen (PCNA) to label cellular proliferation, and vi) isolectin B4 (IB4) to detect microglial cells and blood vessels. The numbers of photoreceptor nuclei rows in the outer nuclear layer and of microglial cells in the different retinal layers were quantified.
To study the population of m+RGCs in P23H-1 rats we have used 30, 365, and 540 days old animals (P30, P365 and P540). As controls, we have used age-matched SD rats. The retinas were dissected as whole-mounts and immunodetected with antibodies against melanopsin and Brn3a to detect m+RGCs and the general population of RGCs, respectively. These populations were quantified and their distribution graphically represented with isodensity maps (for RGCs) and neighbour maps (for mRGCs). In addition, some morphometric dendritic parameters of m+RGCs were analysed.
To investigate the response of macro and microglial cells after one or more intravitreal injections (IVI) we used SD rats. The left eye received one or three (one every 7 days) IVI of anti-rat VEGF (5 ?L; 0.015 ?g/?L), triamcinolone (2.5 or 5 ?L; 40 ?g/?L; Trigón¿ Depot), bevacizumab (5 ?L; 25 ?g/?L; Avastin¿), or their vehicles (PBS and balanced salt solution). Seven days after the last injection retinas were dissected as whole mounts and incubated with antibodies against: i) Iba1, ii) GFAP, and iii) vimentin (to label Müller cells). Macroglial cells were qualitatively analysed, while microglial cells were quantified using a semiautomatic method.
In all studies retinas were examined with a fluorescence microscope, and some retinas that received IVI were observed with confocal microscopy.
Results.
In young animals with inherited retinal degeneration, photoreceptor degeneration starts earlier and progresses quicker in P23H-1 rats than in RCS rats. However, in both models, microglial cell activation occurs simultaneously with the initiation of photoreceptor death while GFAP over-expression in astrocytes and Müller cells begins later. As degeneration progresses, the total numbers of microglial cells in the retina increase and the numbers of microglial cells in the different layers increase in the outer retinal layers, but decrease in the inner retinal layers, more markedly in RCS rats. Microglial cells reach the outer nuclear and outer segment layers in both models. The higher number of microglial cells in dystrophic retinas cannot be fully accounted by intraretinal migration and PCNA immunodetection revealed microglial proliferation in both models, but more importantly in the RCS rats.
Young (P30) P23H-1 rats had significantly lower numbers of Brn3a+RGCs than P30 SD control rats, while the population of m+RGCs was similar in both strains at this age. However, in adult P23H-1 rats there was a decrease in the number of m+RGCs and RGCs of 22.6% and 28.2% at 365 and 540 days of age, respectively. In addition, a decrease in morphometric dendritic parameters of m+RGCs was observed over time in both P23H-1 and P23H-3 rats (a rat line with a slower retinal degeneration).
When analysing the co-expression of Brn3a and melanopsin in the P23H-1 rats, a significantly higher percentage of co-expression of both markers was found in m+RGCs already at P30 (3.31%) when compared to control animals (0.27%). This co-expression increased with age reaching 10.65% at P540.
Finally, in the retinas treated with IVI we found that all the injected substances caused an important micro- and macroglial response locally at the injection site and all throughout the injected retina. This response was exacerbated by repeated IVI. In the contralateral non-injected eyes there was a microglial response as well, but it was milder than in the injected eye. The IVI of the humanized antibody bevacizumab caused a very strong microglial reaction in the treated retina. Two types of macroglial response were observed: astrocyte hypertrophy and Müller end-feet hypertrophy. While astrocyte hypertrophy was widespread throughout the injected retina, Müller end-feet hypertrophy was observed only in a specific area of the retina and was more extensive with triamcinolone or after repeated injections.
Conclusions.
In hereditary photoreceptor degenerations, the observed retinal changes vary depending on the etiopathogenic mechanism. In both models, photoreceptor death and microglial cell activation and migration occurred simultaneously, while the macroglial cell response is delayed. The activation of microglial cells in the degeneration process cannot be explained in the basis only of photoreceptor death: these cells participate more actively in the RCS model. Thus, this model is more inflammatory and would probably respond better to interventions aimed to inhibit microglial cells.
Inherited photoreceptor degeneration was followed by secondary loss of RGCs labelled with Brn3a and mRGCs. Surviving mRGCs showed decreased dendritic morphometric parameters and increased coexpression of Brn3a and melanopsin. These phenotypic and molecular changes may represent an effort of mRGCs to resist degeneration and/or preferential survival of the cells capable of synthesizing Brn3a.
Intravitreal injections cause micro- and macroglial responses that vary depending on the injected agent and the number of injections. The higher the number of injections, the greater the response. This inflammatory glial response may influence the effects of the injected substances on the retina.
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