Brassinosteroids role in arabidopsis root development: theoretical and experimental approaches
- Autores: Irina Paveluscu
- Directores de la Tesis: Marta Ibañes Miguez (dir. tes.), Ana I Caño Delgado (dir. tes.), José María Sancho Herrero (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Crisanto Gutiérrez Armenta (presid.), Jordi Soriano Fradera (secret.), Saúl Ares García (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Física
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Dipòsit Digital de la UB
- Resumen
El tamaño y la estructura de un organismo vivo son el resultado de una coordinación entre procesos moleculares y celulares, altamente dinámicos, como la división, el movimiento, el crecimiento y la deformación. A nivel de tejido se puede usar una descripción mesoscópica del sistema y estos procesos, habitualmente en términos de fuerzas mecánicas y minimización de la energía (dirigirse a (Hamant & Traas, 2010) para una revisión sobre plantas). Por tanto, la morfogénesis y formación de órganos en Eucariotas son investigadas tanto por la Biología de desarrollo como por la Física de la materia blanda (Cross & Greenside, 2009; Cross & Hohenberg, 1993; Murray, 2002).
El crecimiento global de una planta es fuertemente relacionado con el crecimiento y desarrollo de su raíz. Las raíces crecen debido a sucesivas divisiones celulares en el meristemo, seguidas por elongación y diferenciación celular. Para poder estudiar el desarrollo de la raíz es imprescindible conocer qué determina a las células tomar las decisiones de parar de dividir y elongarse o parar de elongarse y diferenciarse. Debido a las fluctuaciones térmicas y el número finito de moléculas que participan en las reacciones moleculares, es de esperar que estas decisiones no son tomadas por todas las células a la vez, sino de una manera estocástica, lo que hace difícil entender cómo la morfogénesis basada en un comportamiento celular estocástico puede generar formas y tamaños característicos de órganos.
Estudios previos, como por ejemplo la formación del patrón de pliegues en el intestino del embrión de aves (Savin et al, 2011) o la minimización de energía a nivel celular en el ala de la mosca Drosophila (Canela-Xandri et al, 2011), hicieron una caracterización física y matemática de los procesos celulares, respaldada por datos experimentales cuantitativos, y han ayudado a entender cómo se genera la forma de un órgano.
En este contexto, esta tesis usa modelos matemáticos para cuantificar y generar predicciones sobre la dinámica de crecimiento de la raíz de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), que han sido testeadas mediante un abordaje experimental. En el Capítulo 2 de esta tesis hemos diseñado un marco teórico para describir el crecimiento estacionario de la raíz y hemos analizado la variabilidad existente entre raíces isogénicas. En el Capítulo 3 hemos usado un modelo matemático para investigar el mecanismo que las células usan para decidir cuándo parar de elongarse y adquirir su tamaño final. Basándonos en las predicciones de este modelo, hemos analizado la variabilidad intrínseca de las plantas silvestres y hemos identificado relaciones específicas entre los parámetros de crecimiento, que nos ayudaron a descartar posibles modelos. En el Capítulo 4 hemos cuantificado la longitud telomérica en las células de la raíz y evaluado funcionalidades biológicas. Nuestro análisis mostró una distribución heterogénea, que impulsó la modelización matemática de la dinámica telomérica, basada en las fluctuaciones y el comportamiento dinámico de la longitud telomérica.
2. RESULTADOS 2.1. Un modelo para cuantificar el crecimiento de la raíz primaria y el efecto de la señalización de los Brassinoesteroides La raíz primaria de la planta modelo Arabidopsis thaliana tiene una estructura muy organizada y estereotípica, en capas, sirviendo muy bien de modelo de desarrollo. Además, las células madre situadas en la punta de la raíz son las más accesibles de toda la planta. Durante el desarrollo, la dinámica celular genera compartimentos a lo largo de la raíz, formados por células con rasgos comunes morfológicos y funcionales, que progresivamente pasan de un compartimento al siguiente.
En el primer capítulo de resultados de esta tesis (Capítulo 2) hemos establecido la cuantificación de raíces individuales. Para caracterizar cuantitativamente el crecimiento estacionario de la raíz, hemos establecido un marco teórico, a partir del cual hemos inferido parámetros morfológicos y dinámicos, mediante dos abordajes. El primer abordaje abarcó el análisis de raíces individuales tanto en la fase transitoria hasta alcanzar el estadio estacionario como en este último, y permitió la identificación y cuantificación de varios parámetros morfológicos clave, que usamos en el capítulo siguiente. Mediante este abordaje hemos desarrollado un método nuevo para separar la zona meristemática de la zona de elongación en cada planta individual analizada, desde el día 1 hasta el día 10 post germinación, en dos tipos celulares: epidermis y cortex. El segundo abordaje utilizado en este capítulo se centró en la caracterización del crecimiento estacionario, que permitió la extracción de información dinámica, como los ritmos de división y elongación y el tiempo que una célula pasa en la zona de elongación.
Utilizando el nuevo método de separación de zonas de la raíz, que describimos en el Capítulo 2, pudimos identificar y caracterizar el factor de elongación celular que, dentro del marco teórico aplicado, está relacionando por con el cociente entre los ritmos de actividad meristemática y de elongación celular. Este factor constituyó una parte importante en el análisis de los mecanismos de diferenciación presentados en el Capítulo 3.
Hemos aplicado este método en epidermis y cortex, durante 10 días desde la germinación, a plantas silvestres y a mutantes bri1-116 del receptor BRI1 de la hormona Brassinoesteroide, descritos por tener defectos en el crecimiento de la raíz. Además, para estudiar la regulación espacial de la raíz hemos analizado plantas con mis-expresión de la señalización de Brassinoesteroides dirigida en un dominio espacial específico: la zona donde las células se dividen. Usando nuestra cuantificación y marco teórico hemos evaluado de forma teórica el efecto individual que la dinámica celular y distintos parámetros celulares del mutante bri1-116 tienen sobre la longitud de la célula madura y sobre el crecimiento de la raíz. Nuestros resultados sugieren que las células maduras más cortas en los mutantes bri1-116 no se deben sólo a defectos en la actividad meristemática y el ritmo de elongación de una célula, sino también a un defecto en el número de células en la zona de elongación. Por otro lado, nuestro análisis revela una posible correlación entre el mecanismo de diferenciación de las células y las dinámicas de división y elongación, lo que ha impulsado un estudio más exhaustivo de la diferenciación, que se lleva a cabo en el Capítulo 3, usando la cuantificación de los parámetros de crecimiento analizados en este capítulo para plantas individuales.
2.2. Un modelo basado en medición de tamaño (Sizer) para la diferenciación celular en la raíz, modulada por la señalización de los Brassinoesteroides Varios trabajos han estudiado la formación de zonas a lo largo de la raíz, proponiendo múltiples mecanismos para explicar qué determina a las células salir de una zona y entrar en la siguiente. Se ha descrito que la transición desde la zona meristemática hasta la zona de elongación puede ser causada por la capacidad de las células de sensar gradientes de morfogénos, medir escalas temporales o medir su longitud. Por otro lado, el mecanismo de diferenciación celular que para la elongación de las células está poco caracterizado.
Varios estudios computacionales, basado en gradientes de morfogénos o proteínas (Ruler) (Band et al, 2012; De Vos et al, 2014), en mediciones de tamaño (Sizer) (Grieneisen et al, 2007) o en estimación de tiempo (Timer) (De Vos et al, 2014; Mähönen et al, 2014), han propuesto diferentes mecanismos para explicar la salida de la zona elongación y la entrada en la zona madura, de diferenciación. Sin embargo estos distintos mecanismos no han sido contrastados entre sí.
En este capítulo hemos usado un abordaje computacional para averiguar cómo las células deciden cuando dejar de crecer y devenir maduras. Para ello, hemos analizado los modelos Ruler, Timer y Sizer en base a los valores de los parámetros extraídos en el Capítulo 2 del análisis de plantas individuales. Nuestros resultados computacionales y teóricos muestran que aunque todos los mecanismos generan un comportamiento similar a nivel cualitativo e incluso, en algunos casos, cuantitativamente a nivel promedio, presentan diferencias cuantitativas de variabilidad distinta entre los rasgos fenotípicos, específica para cada modelo. Hemos evaluado de forma empírica estas relaciones, analizando la variabilidad fenotípica que se observa entre raíces del ecotipo Col-0 y hemos propuesto que un mecanismo de tipo Sizer está actuando en la diferenciación final de las células de la epidermis y del cortex. De manera interesante, hemos encontrado que mutantes con múltiples defectos en la raíz, como los mutantes de la vía de señalización de los BRs bri1-116, apoyan este modelo también. Además, estos resultados revelan que los BRs modulan de forma cuantitativa la relación lineal característica al modelo Sizer, estableciendo un umbral más bajo de longitud celular para la diferenciación. En este capítulo también mostramos que la señal de los BRs en la zona de división es suficiente para rescatar el umbral, y asimismo el ritmo de crecimiento de la planta silvestre, aunque el mecanismo de diferenciación involucrado es ligeramente alterado.
En resumen, en este capítulo proponemos un mecanismo para la diferenciación celular en la raíz y proporcionamos un abordaje para investigar el desarrollo estacionario de la raíz.
2.3. Cuantificación de la longitud telomerica en células individuales Un factor importante que limita la capacidad replicativa de las células es la longitud telomérica. Los telómeros son unidades ribonucleicas que protegen los extremos de los cromosomas eucariotas y que se acortan un tamaño predeterminado con cada división celular. Por ello, cuantificar la longitud de los telómeros en una célula es indicador de cuantas divisiones ha experimentado.
En el capítulo 4 de esta tesis hemos analizado la correlación entre la actividad meristemática y la longitud telomérica la raíz primaria de Arabidopsis. Para este fin hemos cuantificado la longitud telomérica promedio en cada célula, a través de un método nuevo de hibridación in-situ y cuantificación de intensidad de fluorescencia telomérica. La implementación de un nuevo protocolo de análisis de imagen reveló por primera vez un mapa de distribuciones teloméricas en la raíz, con gradientes de longitud telomérica a lo largo del meristemo y con los telómeros más largos localizados en el nicho de las células madre. Hemos aplicado este método en plantas silvestres, en varias generaciones de mutantes sin telomerasa (la enzima que alarga los telómeros), en mutantes de la vía de señalización del daño en el ADN y en mutantes de la diferenciación celular. Nuestro análisis enseñó que la longitud telomérica es un buen indicador del historial de divisiones. A continuación, hemos generado plantas transgénicas para investigar la localización de la transcripción de la telomerasa en la raíz primaria y hemos evaluado la relación existente entre la longitud telomérica y la resistencia al daño en el ADN.
El acortamiento de los telómeros se considera un proceso estocástico y la cuantificación de sus longitudes permite el análisis de su dinámica, midiendo sus desviaciones o fluctuaciones (Xu et al, 2013). Teniendo esto en cuenta, hemos evaluado de manera computacional las distribuciones de longitud telomérica promedia descritas en esta tesis para la planta silvestre y para los mutantes de la telomerasa y hemos simulado la dinámica que podría dar lugar a este tipo de distribuciones. Para las simulaciones hemos asumido un ritmo de división constante y un intervalo de tiempo estocástico entre las divisiones sucesivas y hemos considerado que el fragmento con cual se acorta el telómero no depende de su longitud. Además, hemos impuesto que la telomerasa actue sólo en las células madre. Aplicando estos criterios, primero hemos reproducido la distribución del nicho de células madre en el mutante G5 tert partiendo de la distribución del nicho de la planta silvestre. A continuación, hemos aplicado la misma dinámica de acortamiento para simular las distribuciones de los tipos celulares que no tienen telomerasa y hemos reproducido los resultados experimentales, lo que sugiere que una dinámica estocástica sencilla puede explicar el acortamiento telomérico observado en las plantas reales.
3. Perspectivas El marco matemático usado en el Capítulo 2 para describir el crecimiento de la raíz ha permitido caracterizar un mutante de BRs y entender el papel de esta hormona en los procesos celulares que controlan el desarrollo de la raíz. No obstante, nuestro análisis no proporciona detalles sobre el papel individual de los elementos involucrados en la vía de señalización de los BRs. Los principales factores de transcripción aguas abajo del receptor BRI1 son BES1 y BZR1, conocidos por su papel distinto en la transducción de señal de los BRs (Gudesblat & Russinova, 2011; Sun et al, 2010; Yu et al, 2011). Sería interesante saber si estos factores de transcripción afectan de manera diferente los parámetros extraídos en el Capítulo 2 de esta tesis.
En el Capiíulo 3 de esta tesis hemos propuesto un mecanismo tipo Sizer para la decisión celular de diferenciarse, pero los componentes moleculares que contribuyen a este mecanismo no se conocen y deberían investigarse. Dado que hemos encontrado diferencias entre las plantas silvestres y los mutantes bri1-116 en el umbral de longitud celular necesaria para la diferenciación, una posible forma de ejecutar el mecanismo Sizer sería contando el número de endoreduplicaciones (Costas et al, 2011; Gutierrez, 2009; Sugimoto-Shirasu & Roberts, 2003). Otra posibilidad sería mediante un mecanismo de dilución que podría medir cambios en la longitud celular, relacionado con el crecimiento de la vacuola o la activación de las proteínas de pared, procesos que van controlados por los BRs (Fabregas et al, 2013; Witthoft & Harter, 2011).
El abordaje teórico utilizado en el Capítulo 3 está reduciendo la raíz a una sola fila de células. Un modelo más completo debería ser desarrollado para entender mejor las dinámicas específicas a cada tipo celular y cómo estas afectan el crecimiento global de la raíz. Este modelo debería proporcionar geometrías más realistas de las células y considerar los aspectos mecánicos del desarrollo de la raíz, como la tensión generada por el mismo crecimiento.
En el Capítulo 4, al modelar las distribuciones teloméricas de la raíz, hemos encontrado diferencias entre los tipos celulares sin telomerasa, en el número de divisiones, que podrían ser debidas a diferencias en los ritmos de división o en el número de bases que se pierden en cada división. En nuestro análisis telomérico, hemos partido de la distribución experimental de las células madre de las plantas silvestres. Sería interesante poder reproducir esta distribución aplicando una dinámica de acortamiento y alargamiento estocástico de los telómeros.
