Resumen de Estudio cristalográfico de los mecanismos de especificidad y diseño molecular de glicosidasas para la producción de oligosacáridos prebióticos y derivados bioactivos
- español
Según diversos estudios epidemiológicos, la dieta tiene un efecto directo sobre la composición y el equilibrio de la microbiota intestinal y, ésta, sobre la salud del individuo. Por ello se buscan nuevos alimentos funcionales, como los oligosacáridos prebióticos, que son capaces de estimular el crecimiento de bacterias beneficiosas.
Por otra parte, la glicosilación de distintos compuestos químicos mejora sus propiedades y su biodisponibilidad. Estos nuevos compuestos bioactivos aún no están tan desarrollados como los prebióticos, pero tienen una gran proyección de futuro en la industria farmacéutica.
La investigación para mejorar la biosíntesis de estos productos conlleva tanto el estudio de nuevos compuestos con mejores propiedades funcionales como la búsqueda de formas más eficaces de producirlos. En este aspecto, la Biotecnología Enzimática se ha impuesto frente a otras metodologías de química tradicional. Y para profundizar en esta metodología, la Cristalografía de rayos X genera la información estructural básica para el diseño racional en la Ingeniería de proteínas.
Por todo ello, esta tesis se ha centrado en el estudio cristalográfico de glicosil hidrolasas GH , enzimas capaces de hidrolizar o sintetizar carbohidratos. Estas enzimas, altamente específicas y eficientes, intervienen en multitud de procesos biológicos fundamentales y son utilizadas en diversos procesos industriales, por lo que un conocimiento detallado de su función a nivel molecular es clave para entender su papel biológico, además de permitir un diseño racional de nuevas y mejoradas variantes para su aplicación biotecnológica.
En este manuscrito, se presentan cuatro trabajos de investigación realizados con enzimas productoras de carbohidratos prebióticos.
Las primeras enzimas estudiadas en esta tesis son la invertasa de Saccharomyces cerevisiae ScInv y la b fructofuranosidasa de Xanthophyllomyces dendrorhous XdInv , ambas de la familia GH32 y productoras de prebióticos tipo FOS fructooligosacáridos . Nuestros estudios cristalográficos han revelado que el domino b sándwich es responsable de la oligomerización y que este ensamblaje molecular regula la especificidad de substrato de las enzimas GH32 de levadura. Así, ScInv produce 6 kestosa mientras que XdInv sintetiza neokestosa, oligosacáridos con marcada capacidad prebiótica. Además, XdInv es capaz de fructosilar otros carbohidratos, e incluso otros compuestos no azúcares, por lo que se está investigando su uso para la generación de nuevos compuestos bioactivos.
Por su parte, la alfa glucosidasa de Xanthophyllomyces dendrorhous Xd alfaGlu es una enzima con capacidad de producir IMOS isomaltooligosacáridos del tipo alfa 1 6 de longitud media, con mejores propiedades funcionales y prebióticas. El modelo estructural por homología de secuencia revela que presenta una topología típica de las enzimas GH31, pero muestra un inserto en el dominio N terminal y un Inserto 2 inusualmente largo en el dominio catalítico. Estas dos nuevas características estructurales pueden ser las responsables de su preferencia por substratos largos.
Por último, hemos estudiado una b glicosidasa aislada del metagenoma de rumen bovino GlyA1 . Su estructura revela una permutación de dominios, aunque conserva la arquitectura general de las b glucosidasas de la familia GH3. Además, GlyA1 tiene un dominio extra C terminal que, según los análisis de dispersión de rayos X a bajo ángulo SAXS , debe situarse sobre el núcleo estructural de la enzima. Hemos demostrado que esta nueva topología está asociada a microorganismos que habitan en el tracto digestivo y que dependen de una dieta rica en biopolímeros vegetales. Esta enzima es una b glucosidasa b xilosidasa que presenta además otras actividades asociadas, con capacidad de degradar oligosacáridos con distinto tipo de enlace y grado de polimerización.
- English
Several epidemiological studies have shown that food plays a key role in human health. It has been shown that diet has a direct effect on the composition and balance of the intestinal microbiota and this, in turn, on health. Therefore, new "functional" foods are sought, many of which are prebiotic oligosaccharides that selectively stimulate the growth of beneficial bacteria. On the other hand, the glycosylation of different chemical compounds improves their properties and their bioavailability. These new bioactive compounds have yet to be fully exploited, being increasingly demanded by the pharmaceutical industry. Research on biosynthesis of these products involves the study of new compounds with better functional properties and, also, the development of more efficient production methods. Thus, Enzymatic Biotechnology has overcome other traditional chemical methodologies, due to its excellent regio-‐, chemo-‐ and stereo-‐specificity. Furthermore, X-‐ray crystallography generates the basic structural information for rational design and protein engineering. Accordingly, this thesis has focused on the crystallographic study of glycosyl hydrolases (GH), enzymes that metabolize carbohydrates, the most structurally diverse biocompounds in nature. These highly specific and efficient enzymes are involved in many essential biological processes. A detailed knowledge of their molecular function is crucial to understand these processes and control numerous diseases, and is necessary to optimize their biotechnological application. In this manuscript, we present the research work performed on four enzymes that can generate prebiotics of the types FOS (fructooligosaccharides), IMOS (isomaltooligosaccharides) or β-‐glucans. In addition, we have explored their ability to synthesize other bioactive compounds. The general goal of the work is to shed light into the intricate mechanisms of protein-‐ carbohydrate recognition that modulate the specificity of glycosidases, through protein crystallography. In addition to the fundamental implications for understanding the processes in which these enzymes are involved, this structural knowledge is crucial for performing the molecular engineering of enzymes. The ultimate goal is to produce oligosaccharides with prebiotic properties, specifically designed to manipulate the individual's intestinal microbiota, opening the door to personalized preventive medicine...
