Caracterización de proteína-fosfatasas de tipo 1 de Leishmania infantum y estudio mediante RNA-Seq de las alteraciones en la expresión génica diferencial inducidas en líneas Knock-in

• Autores: Maria Angelica Degayon Cortes
• Directores de la Tesis: Pedro José Alcolea Alcolea (dir. tes.), Ana Maria Alonso Ayala (dir. tes.), Vicente Larraga Rodríguez de Vera (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Número de páginas: 225
• Tribunal Calificador de la Tesis: Luis Miguel Ortega Mora (presid.), Gema Álvarez García (secret.), Antonio Jiménez Ruiz (voc.), José M. Requena Rolanía (voc.), Mercedes Moreno Paz (voc.)
• Materias:
  • Ciencias agrarias
    • Ciencias veterinarias
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense (pdf)
• Resumen
  • español

    La leishmaniasis visceral es una zoonosis causada por el parásito Leishmania infantum en la cuenca mediterránea. Las proteínas fosfatasas tipo 1 (PP1) son las principales serina-treonina fosfatasas presentes en los organismos eucariotas y participan en la regulación de diversos procesos celulares. El papel de dichas proteínas apenas ha sido estudiado en el género Leishmania. De acuerdo a los análisis de expresión génica diferencial llevados a cabo mediante microarrays de ADN (Alcolea y cols. 2010), la PP1 LinJ.15.0240 (PP1-240) y ciertas PP1 codificadas por el cromosoma 34 (cluster PP1-34) están diferencialmente expresada a lo largo del ciclo biológico de L. infantum. Aún habiéndose puesto de manifiesto en diversos estudios la importancia del estado de fosforilación proteico durante los procesos de diferenciación del parásito, la funcionalidad concreta de las PP1 en Leishmania spp es desconocida, al igual que las vías de señalización intracelular en general.

    El objetivo fundamental de esta tesis doctoral es la caracterización de la PP1 codificada por el gen LinJ.15.0240 (PP1-240) y del cluster de PP1 localizado en el cromosoma 34 (LinJ.34.0820, LinJ.34.0830, LinJ.34.0840, LinJ.34.0850) de L. infantum (cluster PP1-34). Dicha caracterización incluye el estudio de la estructura primaria, el análisis de la expresión génica en los diferentes estadíos el ciclo biológico del parásito, el estudio de la localización subcelular y el estudio de las alteraciones en la expresión génica diferencial global en líneas de promastigotes axénicos knock in, es decir, transfectantes estables que sobre-expresan de forma constitutiva PP1-240 o el cluster PP1C-34.

    En síntesis, los estudios llevados a cabo en esta tesis doctoral han revelado: i) alto grado de conservación de las secuencias de las proteínas-fosfatasas PP1-240 y del cluster PP1-34 de L. infantum; ii) predominio de la sub-expresión en los perfiles de expresión génica diferencial detectados en líneas knock-in de sobre-expresión de las PP1 en estudio; iii) influencia de las PP1 en procesos celulares relacionados con la transcripción, traducción, modificación post-traduccional de proteínas, el ciclo celular, el transporte y las moléculas de superficie; iii) una posible implicación de la proteína PP1-240 en procesos de diferenciación celular como sugieren la sub-expresión de los marcadores de metaciclogénesis SHERP y meta 1 en la línea de sub-expresión pIR-PP1-240; iv) la inducción de estrés celular en las líneas de sobre-expresión de las proteína-fosfatasas en estudio por la detección de los genes A2 y peroxidasa; v) la vinculación de las proteínas codificadas por el cluster PP1-34 con procesos relacionados con el citoesqueleto y flagelo. Por tanto, estos resultados representan un avance en el conocimiento sobre la funcionalidad de las PP1 en L. infantum. Además, teniendo en cuenta los avances científicos realizados en los últimos años (Peti y Page, 2015), las PP1 y los posibles sustratos de interacción identificados podrían representar potenciales dianas de acción en el área de la terapéutica clínica frente a la leishmaniasis. Futuros ensayos basados en el estudio del interactoma de las PP1 en L. infantum podrían contribuir a la identificación de tales dianas farmacológicas para el tratamiento de la leismaniasis.

  • English

    Leishmania infantum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) is the causative agent of visceral leishmaniasis in the Mediterranean Basin, where dogs are the main reservoir. The infection is transmitted to the mammalian host by the bite of dipteran of the subfamily Phlebotominae. The life cycle of the parasite is digenetic and two stages alternate: the motile promastigote stage which develops in the invertebrate host and the non-motile amastigote stage, which multiplies within phagocytes of the mammalian host. Genome sequencing of the main Leishmania species was published between 2005 and 2007, and the development of high-throughput techniques, such as DNA microarrays, quantitative proteomics, and more recent methods based on next generation sequencing, have made exhaustive analysis of gene expression profiles of the parasite possible throughout the life cycle. This has been performed in order to find possible virulence factors involved in pathogenicity and/or possible therapeutic targets and vaccine candidates. In a previous comparative transcriptomics analysis performed in the laboratory of Molecular Parasitology of the Biological Research Center (CSIC), differential expression of the genes LinJ.34.0840 and LinJ.15.0240 encoding protein phosphatases 1 (PP1) was described in promastigotes isolated from the vector Phlebotomus perniciosus. Even though it has become clear that the phosphorylation status of protein is remarkable during the differentiation processes of the parasite, funcionality of PP1 proteins from Leishmania spp. is not known accurately so far, as well as the signalling pathways in general. For this reason, characterization of these proteins was proposed to develop this doctoral thesis, which has been carried out in the laboratory mentioned...