Resumen de Evaluación de lesiones hepáticas y respuesta inmunitaria local en ovejas vacunadas con cl1 e infectadas con fasciola hepatica
1. Introducción o motivación de la tesis La fasciolosis sigue siendo una de las enfermedades parasitarias de mayor repercusión económica en la producción ganadera. Actualmente el control de la enfermedad en rumiantes se basa en el uso de fármacos antihelmínticos, sin embargo, el desarrollo de resistencias y la introducción de residuos farmacológicos en la cadena alimenticia han producido un creciente interés en el desarrollo de estrategias de control inmunológico, lo que evitaría esos inconvenientes y permitiría una protección más duradera, con mayor repercusión epidemiológica en la lucha contra la enfermedad (Molina-Hernández et al., 2015). Los resultados obtenidos en ensayos de vacunación con diversos antígenos permiten considerar que el control inmunológico de la fasciolosis de los rumiantes es una posibilidad real, sin embargo, los resultados han sido variables en distintos ensayos. Para mejorar la eficacia de las vacunas en rumiantes se requiere conocer los mecanismos de protección inmunitaria y la determinación de las formulaciones vacunales óptimas, válidas para distintas especies animales (Flyn et al., 2010). En modelos experimentales como la rata se ha demostrado que la respuesta inmunitaria eficaz ocurre durante fases tempranas de la infección, concretamente en lámina propia de duodeno y en peritoneo (Van Milligen et al., 1999, Kesik et al., 2007). Sin embargo, hasta la fecha los ensayos vacunales en rumiantes se han centrado en evaluar la carga parasitaria y respuesta inmunitaria en fases tardías de la infección (Zafra et al., 2008; Zafra et al., 2010). En el presente trabajo hemos llevado a cabo un ensayo vacunal en la especie ovina para evaluar las lesiones y respuesta inmunitaria en fases tempranas de la infección, así como la carga parasitaria, lesiones hapáticas. La técnica usada para la valoración de la expresión génica es la Real-time PCR y con ella se valoraran la respuesta Th1, Th2 y linfocitos T reguladores (Treg) en las cuales hay involucradas diferentes tipos de citoquinas. La respuesta Th1 tiene un papel importante contra el parásito ya que se ha demostrado que produce cierta protección (Mulcahy et al., 1999) pero el parásito tiene la capacidad de modular la respuesta inmune del hospedador a favor de una respuesta Th2 la cual no es suficiente para acabar con el parasito. Los linfocitos Treg juegan un papel importante ya que suprimen el desarrollo de la respuesta Th1 y limita también la magnitud de la respuesta Th2, permitiendo así la supervivencia del parásito y regulando el daño tisular en el hospedador. Como candidato vacunal se ha seleccionado Catepsina L1 (CL1) de Fasciola hepatica por los resultados previos prometedores demostrados en bovinos (Golden et al., 2010, ovina (Villa Mancera y Méndez-Mendoza 2012).
2. Contenido de la investigación Para el estudio se realizaron dos experiencias, en la primera se utilizaron 44 ovejas hembras de Raza Merina de 7 meses de edad, libres de F. hepatica., que se distribuyeron en tres grupos. El grupo 1 (n=20) fueron inmunizadas con CL1 recombinante de F. hepatica (rCL1) en adyuvante Montanide ISA 70 VG. El grupo 2 (n=20) se usó como controles no vacunados e infectados, y el tercer grupo y el grupo 3 (n=4) como controles negativos no infectados ni vacunados. Los grupos 1 y 2 se infectaron oralmente con 200 metacercarias de F. hepatica. Ambos grupos a su vez se dividieron cada uno en 4 subgrupos (n=5) que fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi).
En la segunda experiencia se usaron 34 ovejas, hembras, de raza Merina de la misma edad, que fueron divididas en 3 grupos. El grupo 4 (n=13) estaba compuesto por animales inmunizados de igual forma que el grupo 1. El grupo 5 (n=12) correspondió a animales inmunizados sólo con el adyuvante y finalmente el grupo 6 (n=9) que fue usado como control de infección. Estos 3 grupos fueron infectados oralmente con 150 mc de F. hepatica y sacrificados a las 19 semanas post infección (spi) para valorar la carga parasitaria. Para valorar la eficacia protectora de dicha vacuna se hizo un contaje del número de parásitos adultos en fases crónicas de la infección, no existiendo diferencias significativas en la reducción de la carga parasitaria entre los grupos 4 (vacuna CL1) y los grupos 5 y 6. En fases tempranas el estudio patológico mostró mayor número de lesiones hepáticas macroscópicas a los 9 dpi en el grupo 1 (vacunado) que en el grupo 2 (control de infección), sin embargo, a los 18 dpi las lesiones en ambos grupos eran similares. La fibrosis periportal mostró un incremento progresivo en los grupos 1 y 2 a los 9 y 18 dpi, cuando fue más severa en el grupo 2 en comparación con el grupo 1.
La respuesta inmunitaria del hospedador se evaluó mediante qRT-PCR, para lo que se hizo una identificación y selección de genes constitutivos ovinos (hígado y NLH) mediante una comparación entre 10 genes diferentes, los más estables para ambos casos fueron PGK1, HSP90AA1 y GYPC.
Se analizó la expresión génica tanto en hígado como en nódulos linfáticos hepáticos(NLH) de las citoquinas IFN-γ e IL-4 (Th1 y Th2, respectivamente). La expresión de IL-4 aumentó a los 9 y 18 dpi y tanto en hígado como NLH de los grupos 1 y 2, en comparación con el grupo 3. La expresión de IFN-γ mostró diferentes dinámicas en hígado y NLH. En hígado aumentó a los 9 dpi en los animales del grupo 1 y a los 18 dpi aumentó en los animales del grupo 1 y 2 con respecto al grupo 3. Este incremento podría ser debido a una respuesta frente al daño hepático con formación de granulomas. En los NLH la expresión de IFN-γ disminuyó de forma gradual y significativa desde 1 dpi en adelante en los grupos 1 y 2 respecto al grupo 3, lo que sugiere que el parásito deprime la respuesta Th1 y estimula la respuesta Th2 para facilitar así su supervivencia. Así mismo, se estudió la expresión de las citoquinas reguladoras IL-10 y TGF-β, así como el factor de transcripción FoxP3 y las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-1β. La expresión de TNF-α, IL-1β, FoxP3, IL-10 y TGF-β mostró un incremento en hígado y NLH de los grupos 1 y 2 a lo largo de la experiencia, particularmente a los 18 dpi. Además, se valoró también la expresión del factor FoxP3 en ambas localizaciones mediante inmunohistoquímica. El número de células FoxP3+ en hígado aumentó significativamente en el grupo 1 y 2 a los 9 y 18 dpi en comparación con el grupo 3, sin observarse diferencias significativas entre los dos grupos infectados. En los NLH, el número de linfocitos FoxP3+ aumentó significativamente en los grupos 1 y 2 respecto al grupo 3 desde los 9 dpi, sin diferencias significativas entre los grupos 1 y 2, siendo menos numerosas en el grupo 1 a los 18 dpi. También hubo una correlación positiva significativa entre la expresión de FoxP3 e IL-10 (por IHQ y qRT-PCR) al igual que entre la fibrosis periportal y la expresión del gen TGF-β.
3. Conclusión La vacunación con catepsina L1 recombinante de F. hepatica con adyuvante montanide isa 70VG no indujo reducción del número de parásitos. Desde fases tempranas de la migración hepática (9 dpi, y particularmente a los 18 dpi) se observó una notable polarización de la respuesta Th2 en detrimento de la respuesta Th1 como demostró el incremento en la ratio IL4/IFN-γ en hígado y NLH. La infección por F. hepática también indujo incremento de la expresión génica de Foxp3, IL-10 y TGF-β así como expresión antigénica de Foxp3, lo que supone una modulación de la respuesta local para facilitar la supervivencia del parásito desde fases muy tempranas de la infección (9 dpi). La expresión de citoquinas proinflamatorias (TNF-α e IL-1β) mostraron un incremento gradual a lo largo de la infección en hígado y NLH tanto en el grupo vacunado como en el control infectado, siendo dicho incremento más notable a los 18 dpi, lo que se corresponde con las mayores lesiones inflamatorias observadas al progresar la infección. No hubo diferencias relevantes para la expresión de citoquinas ni de Foxp3 en hígado y NLH de los grupos 1 (vacunado con CL1) y 2 (control infectado), lo que era de esperar ya que la vacuna no indujo reducción del número de parásitos, aunque sí produjo un retraso en la llegada de las larvas al hígado reflejado por las menores lesiones a los 9 dpi en el grupo vacunado respecto al control infectado.
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