Resumen de Regulación molecular del punto de control epidérmico mitosis-diferenciación en respuesta al daño en el ADN
- español
Durante la expansión y la regeneración de un tejido en desarrollo tiene lugar una fase de rápida multiplicación celular (Slack, 2013). Llegado el momento, ésta debe cesar para evitar una proliferación descontrolada que pueda poner en peligro la integridad y homeostasis del tejido.La apoptosis, senescencia o diferenciación terminal son procesos que limitan la proliferación. La entrada en senescencia, aunque está implicada en la remodelación de tejidos durante el desarrollo (Muñoz-Espin et al., 2013; Storer et al., 2013), se encuentra asociada con algunos efectos perjudiciales como el fomento de desarrollo de tumores y fenotipos degenerativos relacionados con el envejecimiento (Krtolica et al., 2001; Liu y Hornsby, 2007; Baker, et al., 2011; Perrigue et al., 2015). Por otro lado, la apoptosis permite la eliminación física de poblaciones de células durante el desarrollo (Glucksmann, 1965; Chen y Zhao, 1998; Pampfer y Donnay, 1999). En algunos tejidos en desarrollo autorenovables, como la epidermis, la proliferación celular se controla mediante la diferenciación terminal. La diferenciación es el proceso por el cual una célula madre pierde la capacidad de dividirse y se convierte en un tipo celular más especializado, mediante modificaciones de la expresión génica altamente controladas (Slack, 2013). A pesar de su relevancia en la homeostasis de tejidos que se expanden para desarrollar una función específica, los mecanismos moleculares que coordinan la proliferación y la diferenciación son todavía poco conocidos. En esta Tesis se han estudiado estos mecanismos de regulación tomando como modelo de tejido autorrenovable la epidermis.
La epidermis es un epitelio estratificado escamoso que presenta una alta capacidad de auto-regeneración durante toda la vida de los individuos(OpenStax, 2016). Compone la capa mas externa de la piel y su unidad celular básica es el queratinocito. Los queratinocitos proliferan adheridos a la membrana basal en la capa mas interna de la epidermis, conocida como capa basal. Tras una fase inicial de rápida expansión clonal, los queratinocitos pierden adhesión a la membrana basal y comienzan el proceso de diferenciación terminal a la vez que migran por las diferentes capas de la epidermis, hasta que finalmente son eliminados por descamación (Watt, 2014). El proceso de diferenciación esta precedido de un bloqueo mitótico que se vuelve irreversible e impide que los queratinocitos continúen dividiéndose (Gandarillas y Freije, 2014). Los queratinocitos en diferenciación son incapaces de mantener el bloqueo mitótico de manera efectiva y llevan a cabo varias rondas de replicación del ADN en ausencia de división celular, proceso conocido como endoreplicación. De esta manera, los queratinocitos se vuelven poliploides durante el proceso de diferenciación (Zanet et al., 2010). Nuestro laboratorio ha demostrado quela desregulación del ciclo celular por alteraciones oncogénicasinduce un bloqueo mitótico yla diferenciación escamosa (Freije et al., 2012; Freije et al., 2014). Esta observación sugiere que los queratinocitos presentan un punto de control de mitosis-diferenciación (DMC, del inglés differentiation-mitosis checkpoint) que protege a la epidermis de alteraciones oncogénicas. Dada a la importancia del DMC en la homeostasis epidérmica, en esta Tesis se han estudiado los procesos moleculares implicados. Se ha analizado con especial atención el papel del daño en el ADN y de su señalización en el proceso de diferenciación natural de la epidermis.
PAPEL DE p53 EN EL PUNTO DE CONTROL DE MITOSIS-DIFERENCIACIÓN DE QUERATINOCITOS HUMANOS.
Con el objetivo de dilucidar los mecanismos implicados en la activación del DMC en queratinocitos humanos epidérmicos decidimos estudiar el papel de p53, una proteína supresora de tumores. Los resultados derivados de este estudio se publicaron en Cell Reports en 2017(Freije et al., 2014). p53 es un factor de transcripción con un importante papel en la regulación del ciclo celular (Lane, 1992). p53 responde al daño en el ADN con la activación de los puntos de control del ciclo celular mediante sus dianas transcripcionales (Giono y Manfredi, 2006). También es capaz de inducir la apoptosis cuando el daño en el ADN no puede ser reparado (Canman et al., 1994). Por estas razones, hipotetizamos que p53 podría estar mediando la respuesta de diferenciación de los queratinocitos. Para estudiar esta hipótesis, decidimos introducir en queratinocitos primarios una construcción retroviral que sobre-expresaba una proteína p53 mutante termo-sensible (p53ts). Esta proteína presenta su forma activa cuando las células son cultivadas a 32ºC, pero se inactiva mediante un cambio conformacional a 39ºC, comportándose como un mutante dominante negativo (Michalovitz et al., 1990). Para introducir esta construcción en queratinocitos primarios, estos fueron cultivados con el sobrenadante de células AM12productoras de retrovirus. Este método se utilizó para todas las infecciones retrovirales realizadas en esta Tesis.
La proteína exógena p53ts fue eficazmente expresada por los queratinocitos, como se detectó mediante immunofluorescencia (IF) y western blot (WB). p53ts a 39ºC no era capaz de inducir su diana transcripcional p21Cip, ni siquiera en respuesta al daño en el ADN producido por Doxorrubicina (DOXO). Además la p53ts se acumulaba a esta temperatura, como sucede con la proteína mutante inactiva pues deja de ser degradada (Lane, 1992). Estos resultados confirmaron la inactivación de la proteína exógena a 39ºC. Mediante citometría de flujo se observóque a 32ºC en los cultivos que expresaban p53tsse reducía el porcentaje de células con alto tamaño y complejidad.Se sabe que estos parámetros aumentan en queratinocitos durante la diferenciación (Jones y Watt, 1993). También se observó una reducción en la expresión de los marcadores de diferenciación Involucrina y queratina K16 (K16). Por el contrario, la inactivación de p53ts a 39ºC, aumentaba el porcentaje de células en diferenciación. Los resultados mostraban que la inactivación de p53 inducía diferenciación mientras que su activación la inhibía. Además, observamos que tras el tratamiento a 39ºC durante 5 días disminuía la capacidad clonogénica de los queratinocitos, incluso cuando eran relanzados a las condiciones óptimas de cultivo a 37ºC, confirmando que la inducción de diferenciación era irreversible. Estos resultados eran opuestos a lo esperado y mostraban un papel para p53 protector de la capacidad proliferativa de los queratinocitos.
AREG es una proteína de la familia del factor de crecimiento epidérmico EGF. Se ha demostrado que su inhibición activa la diferenciación terminal a través de un bloqueo mitótico (Stoll et al., 2016). Se sabe que AREG se activa transcripcionalmente por p53 en respuesta al daño en el ADN (Taira et al., 2014).Por esta razón decidimos analizar si la sobreexpresión de AREG inhibía la respuesta de diferenciación inducida por la pérdida de p53. Con este objetivo, infectamos queratinocitos primarios con una construcción lentiviral que sobreexpresa AREG o el correspondiente vector vacío. A continuación, los queratinocitos se infectaron con una construcción lentiviral que expresa un short-hairpin ARN (del inglés, shRNA) contra p53 (shp53) o su correspondiente vector vacío. Para ello, se utilizó el sobrenadante de células productoras de lentivirus 293T. Este método se utilizó en todas las infecciones lentivirales descritas en esta Tesis. La sobreexpresión de AREG no fue capaz de rescatar el potencial proliferativo de los queratinocitos perdido por la inhibición de p53. De hecho, mediante PCR cuantitativa (Q-RT-PCR) y citometría de flujo se detectó un aumento del marcador de diferenciación queratina K1. Concluimos que AREG no inhibía la diferenciación inducida por la inhibición de p53.
En conjunto, nuestros resultados sugieren que el papel de p53 en queratinocitos humanos consiste en proteger el potencial proliferativo de estas células.En este sentido, se sabe que la expresión de p53 se pierde al inicio de la diferenciación (Dazard et al., 2000) y que su sobreexpresión inhibe la de marcadores de diferenciación en cultivos organotípicos (Woodworth et al., 1993).Además, los resultados demuestran que la pérdida de p53 induce el programa de diferenciación de los queratinocitos y que esta proteína no es necesaria para la activación del DMC.De hecho, la pérdida de p53 acelera el proceso de diferenciación inducido por la sobreexpresión de MYC (Freije, et al., 2014), sugiriendo que ambas funciones son opuestas. p53 también es capaz de inducir apoptosis en queratinocitos tras la exposición a la luz ultravioleta (Ziegler et al., 1994). Estas observaciones sugieren que p53 tiene un papel dual en el mantenimiento de la epidermis. Por un lado, protegería el potencial proliferativo de las células madreal favorecer la reparación del daño en el ADN mediante la activación de los puntos de control del ciclo celular. Por otro lado, induciría la muerte celular en presencia de un daño tan severo que no pudiese ser reparado.
EL EQUILIBRIO ENTRE PROLIFERACIÓN Y DIFERENCIACIÓN EN LA EPIDERMIS PUEDE DEPENDER DEL PUNTO DE CONTROL MITOSIS-DIFERENCIACIÓN.
Dado que el bloqueo mitótico impuesto por el DMC limita la proliferación de los queratinocitos epidérmicos, sugerimos que alteraciones directamente implicadas en favorecer la mitosis podrían debilitar esta regulación. Para estudiar esta hipótesis, decidimos promover la división celular en queratinocitos que carecían de p53 o sobreexpresaban MYC. Se ha demostrado que ambas alteraciones inducen la diferenciación terminal a partir de un bloqueo mitótico (Gandarillas y Watt, 1997; Gandarillas y Freije, 2014). Con el fin de forzar la división celular a pesar del DMC,sobreexpresamos FOXM1 en estas células. FOXM1 es un factor de transcripción que se expresa en células proliferativas en organismos adultos y se pierde en células quiescentes o en diferenciación (Wierstra y Alves, 2007). Su principal función es promover la mitosis y citoquinesis mediante la transcripción de moléculas directamente implicadas en estos procesos (Costa, 2005). Se considera un oncogén puesto que se encuentra sobreexpresado en diferentes tipos de cánceres humanos, entre ellos los carcinomas epidermoides de piel y de cabeza y cuello (Laoukili et al., 2007; Teh et al., 2013).
Los queratinocitos fueron infectados con una construcción lentiviral que sobreexpresa FOXM1 o su correspondiente vector vacío. A continuación, las células fueron infectadas con una construcción lentiviral que expresa un shp53 o su correspondiente vector vacío, o con una construcción retroviral que sobreexpresa MYC inducible por OHTo el correspondiente vector vacío. Las infecciones se realizaron de manera eficaz, y la sobreexpresión de FOXM1 y MYC o la inhibición de p53 se comprobaron mediante Q-RT-PCR, IF o WB. Es importante que la sobreexpresión de FOXM1 en ausencia de p53 o tras la sobreexpresión de MYC fue capaz de inhibir el bloqueo en G2/M y de reducir el porcentaje de células poliploides, como se detectó por citometría de flujo.Curiosamente, observamos que FOXM1 inhibía el inicio de la transcripción, que se cuantifico mediante la incorporación de 5´-fluoruoridina. Se sabe que la transcripción se produce en interfase y se inhibe durante la mitosis. Sin embargo FOXM1 inhibía la transcripción tanto en células mitóticas que expresaban ciclina A, como en células interfásicas. El gen de FOXM1 codifica para tres isoformas (FOXM1a, b y c), que fueron detectadas en las células mediante WB. Mientras que las isoformas FOXM1b y FOXM1c estimulan la transcripción de sus dianas, la isoforma FOXM1a presenta actividad inhibitoria (Song et al., 2017). Consideramos que la correcta expresión de estas tres isoformas podría ser necesaria para la regulación de la mitosis. Es la primera vez que se propone esta función de FOXM1.
Además de inhibir el bloqueo mitótico, FOXM1 fue capaz de recuperar el potencial proliferativo de los queratinocitos, así como su potencial clonogénico. Mediante IF, Q-RT-PCR y citometría de flujo comprobamos que FOXM1 inhibía la respuesta de diferenciación inducida por la pérdida de p53 o la sobreexpresión de MYC. Este efecto se midió en base a la expresión de marcadores de diferenciación (Involucrina, K1 o Filagrina), los cambios en el aumento en tamaño y complejidad de las células y la pérdida de adhesión celular. Los resultados sugieren que FOXM1 mantiene el potencial proliferativo de los queratinocitos mediante la superación del bloqueo mitótico que da lugar a la diferenciación escamosa.
Los experimentos realizados utilizando la línea celular inmortalizada NTERT confirmaron el papel del DMC en la regulación de la expansión de queratinocitos. Esta línea celular epidérmica presenta expresión ectópica de la subunidad catalítica de la telomerasa humana y de manera espontánea es deficiente en la expresión del inhibidor del ciclo celular p16INK4a (Dickson et al., 2000). Aunque los queratinocitos NTERT no entran en senescencia, sí presentan expresión de marcadores de diferenciación en cultivos organotípicos. Los NTERT fueron tratados durante tres días con inhibidores químicos específicos de las quinasas mitóticas Aurora B y Polo-like 1. Estas quinasas están implicadas en la segregación cromosómica y en la entrada en anafase (Hansen et al., 2004; Ditchfield et al. 2003). Estos tratamientos inducen el programa de diferenciación terminal en queratinocitos primarios a partir del bloqueo mitótico (Freije et al., 2012). Como se observó por citometría de flujo, estos tratamientos indujeron una parada mitótica y un aumento del porcentaje de NTERT poliploides. Además, se indujo la expresión del marcador de diferenciación Involucrina. Mediante ensayos de clonogenicidad, se comprobó que la inducción de la diferenciación producía una perdida irreversible del potencial proliferativo. A continuación, decidimos tratar los NTERT con el inhibidor de la polimerización de microtúbulos Nocodazol (NOCO). Este tratamiento induce el programa de diferenciación terminal en queratinocitos primarios a partir del bloqueo mitótico (Gandarillas et al., 2000). Por el contrario, en NTERT esta respuesta se inducía de manera parcial. Por citometría de flujo, observamos un aumento de poliploidía y de tamaño, consistente con la diferenciación epidérmica. Sin embargo, no se detectó aumento en la expresión de Involucrina y los ensayos de clonogenicidad demostraron que estas células eran capaces de seguir proliferando a pesar de ser poliploides. De esta manera, concluimos que los NTERT presentan una respuesta parcial al bloqueo mitótico y defectos en el DMC que podrían colaborar en su inmortalización. Esta misma respuesta parcial se ha observado en la línea celular derivada de un carcinoma escamoso SCC12F (Alonso-Lecue et al. 2017), indicando que defectos en el DMC podrían estar implicados en la carcinogénesis.
IMPLICACIONES DEL PUNTO DE CONTROL MITOSIS-DIFERENCIACIÓN EN LA CARCINOGÉNESIS EPIDÉRMICA.
Nuestros resultados demostraron que la pérdida de p53 induce la diferenciación escamosa. Se conoce que la mutación de p53 no es un evento iniciador del cáncer de piel, a pesar de que se encuentra frecuentemente mutado en este tipo de cáncer. De hecho, en la piel humana sana se encuentran parches de células con p53 mutada que no dan lugar a carcinogénesis (Jonason, et al., 1996; Ren, et al., 1997;le Pelletier, et al., 2001). Sin embargo, mutaciones en p53 aceleran el desarrollo de cáncer de piel (Kemp, et al., 1993). Nuestros resultados explican esta aparente paradoja.Proponemos que el DMC actúa como un mecanismo de protección contra alteraciones oncogénicas en la epidermis (Gandarillas y Watt, 1997; Freije et al., 2012; Gandarillas y Freije, 2014). Las células con mutaciones en p53 debido a su inactivación, serían expulsadas de la piel por diferenciación y descamación.
Los resultados obtenidos tras la sobreexpresión de FOXM1 apoyan este modelo. FOXM1 permitía la proliferación de células dañadas por la inhibición de p53 o la sobreexpresión de MYC. El nivel de daño fue analizado mediante la cuantificación por citometría de flujo del marcador γH2AX y de las roturas en las hebras de ADN mediante ensayos cometa. En conclusión, ante alteraciones moleculares que desregulan el ciclo celular, el DMC actuaría como una barrera anti-oncogénica disparando la diferenciación terminal. En presencia de alteraciones adicionales que promueven la división celular, como FOXM1, las células mutadas serían capaces de seguir dividiéndose, creando una población de células proliferativas genómicamente inestables que podrían dar lugar al desarrollo del cáncer. FOXM1 también podría tener un papel en el desarrollo de la carcinogénesis independiente del DMC, mediante la inducción de la expresión de β1-integrinas, como se detectó por WB. Puesto que los queratinocitos diferencian al perder adhesión a la membrana basal (Adams y Watt, 1989), el aumento de estas moléculas mantendría su potencial proliferativo.
PAPEL DEL DAÑO EN EL ADN EN EL PROGRAMA NATURAL DE DIFERENCIACIÓN DE LOS QUERATINOCITOS EPIDÉRMICOS.
Los queratinocitos de la capa basal de la epidermis pueden encontrarse en dos estados proliferativos (Watt et al., 2006). Por un lado, las células madre presentan una alta capacidad proliferativa pero se mantiene quiescentes y se dividen infrecuentemente. Por otro lado, las células de amplificación transitoria (del inglés, TACs) proliferan activamente pero están determinadas a diferenciar tras 4-5 ciclos de división celular. La transición de una célula madre a una célula TAC se caracteriza por la activación y posterior desregulación del ciclo celular (Dazard et al., 2000; Zanet et al., 2010; Freije et al, 2102). Sin embargo, que determina las células TAC a diferenciar, es desconocido. Nosotros planteamos que el daño en el ADN que se estaría acumulando en lasTAC por la desregulación del ciclo, podría formar parte del programa natural de diferenciación en la epidermis y establecer el balance entre proliferación y diferenciación. Los resultados obtenidos en esta Tesis apoyan este modelo.
Mediante IF comprobamos que los queratinocitos primarios cultivados in vitroexpresan proteínas implicadas en la señalización y reparación del daño en el ADN, γH2AX y 53BP. El marcador de daño γH2AXtambién se detectó mediante IF en la epidermis in situ. La acumulación de daño en el ADN activa una respuesta celular (DNA damage response en inglés, DDR), que consiste en la detección y señalización del daño, la activación de los puntos de control del ciclo celular y de proteínas implicadas en reparación. En el caso de que el daño no pueda ser reparado, la DDR activa los programas de apoptosis o senescencia (López-Contreras y Fernández-Capetillo, 2012). Se conocen tres quinasas implicadas en la activación de la DDR: ATM, ATR y DNA-PK. Mientras que ATM y DNA-PK responden principalmente a roturas de la doble cadena del ADN, ATR reconoce y se activa por todo un abanico de lesiones típicamente producidas por el estrés del ciclo celular o estrés de replicación (del inglés, RS). Se ha demostrado que la activación de ATR en ausencia de daño en el ADN es suficiente para inducir senescencia (Toledo et al., 2008). Por ello, hipotetizamos que en queratinocitos ATR podría estar mediando la diferenciación escamosa. Infectamos queratinocitos primarios con una construcción retroviral que sobreexpresa la subunidad catalítica de la proteína TopBP1 inducible por OHT (TopBPER a partir de ahora), o su correspondiente vector vacío. TopBP1 es una proteína necesaria para la activación de ATR (Kumagai et al., 2006). Comprobamos por IF y WB que TopBPER se expresaba eficazmente en los queratinocitos y que el tratamiento con OHT inducía su translocación al núcleo. Para comprobar que la activación de ATR era efectiva estudiamos el marcador γH2AX, una de las primeras moléculas fosforiladas por ATR en respuesta al daño (Fernández-Capetillo et al., 2004). Por WB y citometría de flujo comprobamos que el tratamiento con OHT aumentaba la señal de γH2AX. Mediante ensayoscometa confirmamos que el aumento de la señal se debía a la hiperactivación de ATR y no a un aumento real del daño en el ADN. A continuación, analizamos el efecto de la activación de ATR en la diferenciación de los queratinocitos y, por citometría de flujo, observamos que se producía un aumento del tamaño y complejidad celular y de la expresión de Involucrina. También detectamos una importante pérdida de clonogenicidad. Concluimos que la activación de ATR es suficiente para inducir la diferenciación escamosa de los queratinocitos.
En base a nuestros resultados, dedujimos que la inhibición de ATR podría impedir la respuesta a diferenciación de los queratinocitos. Para comprobarlo, infectamos las células con una construcción lentiviral que portaba un shRNA contra la expresión de ATR (shATR) o su correspondiente vector vacio. Mediante Q-RT-PCR comprobamos que la expresión de ATR se inhibió eficazmente. Esta inhibición fue acompañada por un aumento de la señal de γH2AX, que se detectó por IF. Además, por citometría de flujo observamos que la inhibición de ATR activaba los puntos de control de G2/M e inducía un aumento del porcentaje de células poliploides, del tamaño celular y de la expresión de K1. Contrariando nuestra hipótesis, los resultaron demostraron que la perdida de ATR activaba el programa de diferenciación de los queratinocitos. Al mismo tiempo se producía un aumento de la señal γH2AX. En presencia de daño en el ADN, γH2AX es también fosforilada por ATM y DNA-PK (López-Contreras y Fernández-Capetillo, 2012). De manera que interpretamos que probablemente las otras quinasas estaban supliendo la falta de ATR. Por tanto concluimos que existe una relación directa entre la señal DDR y la diferenciación de los queratinocitos, aunque ATR es dispensable para la activación de última.
Con el fin de inhibir completamente la DDR utilizamos inhibidores químicos para las actividades quinasas de ATM, ATR y DNA-PK. Mediante citometría de flujo, observamos que la inhibición de ATM o DNA-PK no influían en la señal de γH2AX. Sin embrago, la inhibición de ATR sí disminuyó γH2AX tras un tratamiento de 5 horas e indujo un drástico incremento de la señal cuando el tratamiento se prolongó hasta tres días como habíamos observado mediante shRNA para ATR. Puesto que ATR es responsable de la reparación de lesiones producidas durante la replicación, su inhibición impide la reparación de este daño. Por tanto, el aumento de γH2AX (señal daño en el ADN) al inhibir ATR (la reparación) sugiere que el RS es una importante fuente de daño endógeno en los queratinocitos en proliferación.
La inhibición conjunta de ATR y ATM aumentó aún más la señal de γH2AX. Además, mediante ensayo cometa se observó un incremento de las roturas en el ADN, lo que sugiere que ATM participa en la reparación de lesiones producidas por RS en ausencia de ATR. Esta respuesta fue de nuevo acompañada por un aumento de la diferenciación terminal, según la expresión de marcadores de diferenciación Involucrina y K1 y el aumento del tamaño y complejidad celulares. Sin embargo, la inhibición simultanea de ATR, ATM y DNA-PK atenuó la señal de γH2AX, como se detectó por IF y citometría de flujo. Esta disminución se produjo en ausencia de un descenso de la fragmentación del ADN en ensayos cometa. Tanto IF como citometría de flujo, mostraron una inhibición de la expresión de Involucrina y K1. Mediante ensayos de clonogenicidad, también se observó una recuperación parcial de la capacidad clonogénica. Por lo tanto, la entrada en diferenciación parece estar mediada por la señal de γH2AX.
Para confirmar esta hipótesis, inhibimos la señal γH2AX. Utilizamos una construcción lentiviral que expresa un shRNA contra H2AX, o su correspondiente vector vacío. La inhibición de H2AX se realizóeficazmente, como pudimos comprobar mediante IF, WB y Q–RT-PCR. Como esperábamos, al silenciar H2AX inhibimos la señal de γH2AX, según sedetectó por WB y citometría de flujo. La inhibición de γH2AX no solo fue acompañada DE una disminución de los marcadores de diferenciación escamosa, sino también dela del marcador de epitelio escamoso queratina K5. Además, aumento la expresión del marcador de epitelio simple queratina K8. La bajada de K5 y el aumento de K8 están asociados con la transición epitelio-mesénquima (TEM, Caulin et al., 1993). Estos resultaron, apoyan la hipótesis de que γH2AX media la diferenciación escamosa en respuesta al daño en el ADN.
Basándonos en el conjunto de resultados obtenidos, proponemos un modelo que explicaría la relación entre la proliferación y la diferenciación normal de los queratinocitos epidérmicos. Los queratinocitos basales proliferando activamente estaríandeterminadosa diferenciardebido a la acumulación de daño en el ADNpor el estrés del ciclo celular. Este modelo sugiere que existe una respuesta diferenciaciónal daño en el ADN (DNA damage-differentiation response en inglés, DDDR). La DDDR establecería un mecanismo automático auto-limitante de la proliferación y de la iniciación de la diferenciación. Además, proponemos que este modelo podría funcionar en otros tejidos que proliferan activamente durante el desarrollo o la regeneración.
Nuestros resultados sugieren que la entrada en diferenciación en respuesta al daño en el ADN es dependiente de la señal de γH2AX. Sin embargo, esta relación parece ser parcial, puesto que la inhibición de γH2AX no inhibe completamente la diferenciación escamosa. Con el fin de identificar nuevas moléculas involucradas en la DDDR, que responden a γH2AX o que son independientes de esa señal, secuenciamos el transcriptoma de queratinocitos primarios tras activar el DMC utilizando cuatro tratamientos diferentes. Estos experimentos se realizaron con la colaboración del Centro Nacional de Análisis Genómico (CNAG) y del laboratorio del Dr. JT Elder en la Universidad de Michigan, dónde realicé una estancia financiada por la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO). Una vez identificados los genes diferencialmente expresados en cada tratamiento en base a su significancia estadística, los comparamos y seleccionamos aquellos cuya expresión aumentaba o disminuía comúnmente en los cuatro tratamientos. Se identificaron 40 genes cuya expresión disminuía y 15 cuya expresión aumentaba. En futuros estudios se validarán estos resultados y se estudiará el papel de estos genes en la DDDR de queratinocitos
- English
During expansion and regeneration developing tissues undergo a rapid phase of cell proliferation that needs to stop at some to control tissue homeostasis. The epidermis is an squamous stratified epithelia with a high self-renewal capacity. The epidermis is considered as an adult developing tissue and can be use as a model for the study of the molecular mechanism maintaining the balance between proliferation and differentiation. In this Thesis we have studied the role of the cell cycle checkpoints and the DNA damage response in the regulation of these mechanisms. In addition, we have search for novel molecules involved in the activation of the squamous differentiation response.
