El transportador labcg2 de leishmania: avances funcionales asociados con resistencia a fármacos, infectividad y metabolismo de tioles

• Autores: Ana Perea Martínez
• Directores de la Tesis: Francisco Gamarro Conde (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Dolores González Pacanowska (presid.), Maria Paz Carrasco Jimenez (secret.), Luis Ignacio Rivas López (voc.), José M. Requena Rolanía (voc.), Antonio Manuel Estévez García (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Granada
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen

  • La leishmaniasis es un conjunto de patologías producidas por varias especies del protozoo parásito Leishmania. Está considerada como la segunda enfermedad más importante causada por parásitos después de la malaria. Se estima que 350 millones de personas en el mundo se encuentran en riesgo de padecer la enfermedad, con 0,9-1,3 millones de casos nuevos y entre 20.000-30.000 defunciones al año con 12 millones de casos clínicos entre la población mundial, entre los que se distinguen 0,7-1,3 millones de casos de leishmaniais cutánea y 0,2-0,4 millones de casos de leishmaniasis visceral.

    Aunque se han obtenido resultados prometedores para la elaboración de distintas vacunas frente a la leishmaniasis, por ahora no existe ninguna vacuna eficaz y exenta de riesgos, ni métodos eficaces de control del insecto vector.

    Por lo tanto, la única herramienta actual de lucha frente a la leishmaniasis es la quimioterapia. Actualmente existe un reducido arsenal de fármacos para el tratamiento de la leishmaniasis, y su eficacia se está viendo comprometida, entre otros factores, por la aparición de resistencias a los fármacos de primera línea de acción como los antimoniales. En la India, el fallo terapéutico alcanza al 60% en pacientes con leishmaniasis visceral, debido a un incremento en la resistencia a fármacos basados en antimonio como los antimoniales pentavalentes.

    Un mecanismo crucial de resistencia a antimonio en Leishmania implica la disminución de la concentración intracelular del fármaco mediante su eflujo a través de transportadores ABC. Los transportadores ABC representan una de las familias más amplias de proteínas descritas. Están altamente conservadas desde procariotas a humanos y juegan papeles fisiológicos clave transportando diferentes compuestos a través de las membranas biológicas. En Leishmania major hay 42 genes que codifican para transportadores ABC. Teniendo en cuenta la homología en las secuencias de los dominios de transmembrana y de unión al ATP, los transportadores ABC en Leishmania se agrupan en 9 subfamilias (ABCA-ABCI). Los transportadores ABC de eucariotas pueden codificar para full-transporters o half-transporters, como es el caso de la subfamilia ABCG, que presentan su dominio de unión al ATP en el extremo N-terminal y necesitan homo o heterodimerizar para reconstituir los sitios de unión a ATP y generar una proteína activa.

    A lo largo de la presente tesis doctoral se ha estudiado la implicación del transportador LABCG2 en la resistencia a fármacos, infectividad y metabolismo de tioles en Leishmania. El transportador LABCG2 pertenece a la subfamilia de transportadores ABCG y tiene dos repeticiones imperfectas adicionales en tándem en el cromosoma 6 de Leishmania conocidas como LABCG1 y LABCG3. LABCG1 y LABCG2 presentan un 95% de identidad, pero la proteína LABCG3 está truncada y no es un transportador funcional.

    Datos previos demuestran la implicación de otros transportadores ABCG en la resistencia a fármacos, lo que hace interesante conocer la función de LABCG2 en este área. En este trabajo de Tesis Doctoral hemos comprobado que la sobreexpresión de LABCG2 en formas promastigotes de Leishmania confiere resistencia a SbIII debido a una menor acumulación de este compuesto por un incremento de su eflujo, probablemente como complejos tiol-SbIII. Además, hemos observado que la resistencia a SbIII se mantiene en las formas intracelulares amastigotes, que muestran también resistencia a SbV. Adicionalmente, los parásitos que sobreexpresaban el transportador LABCG2 presentaron un reducido contenido interno de tioles no proteicos, así como un eflujo significativo de los mismos al medio sin la necesidad de conjugarse a SbIII. Mediante ensayos de biotinilación hemos detectado la presencia del transportador LABCG2 en la membrana plasmática de Leishmania. Este resultado, en conjunción con estudios anteriores de localización subcelular, sugiere que este transportador está localizado en vesículas intracelulares que se fusionarían con la membrana plasmática liberando el contenido al medio extracelular.

    Además de su papel en la resistencia a fármacos, a lo largo del presente trabajo de Tesis Doctoral hemos demostrado que LABCG2 está también implicado en la infectividad de Leishmania, puesto que parásitos mutantes nulos para LABCG1-2 presentan una reducción en el porcentaje de infección y entrada a los macrófagos. Adicionalmente, empleando un modelo murino de leishmaniasis, se ha observado que estos parásitos generan menos inflamación y lesiones en las patas de los ratones infectados, destacando la importancia del transportador LABCG2 para el desarrollo de la enfermedad.

    En este trabajo de Tesis Doctoral demostramos que los parásitos mutantes nulos para LABCG1-2 tienen reducido el porcentaje de células con autofagosomas, el cual aumenta al depletar los niveles de tioles intracelulares. Además, esta línea presenta un contenido interno de tioles no proteicos significativamente mayor que la línea salvaje, siendo GSH y T(SH)2 las principales moléculas acumuladas. En consonancia con estos resultados, hemos demostrado que tanto los tioles GSH y T(SH)2 como sus formas oxidadas GSSG y T(S)2 estimulan la actividad ATPasa basal del transportador LABCG2 expresado en vesículas de membranas de células Sf9, siendo T(SH)2 y TS2 los compuestos que generan una mayor estimulación. De hecho, LABCG2 es capaz de transportar 3H-GSH al interior de dichas vesículas de forma dependiente de ATP. Probablemente LABCG2 también transporta GSH, GSSG, T(SH)2, TS2 y Metil-GS, ya que se ha observado que estos compuestos, especialmente T(SH)2 y TS2, compiten por la acumulación de 3H-GSH.

    En resumen, hemos demostrado que el transportador LABCG2 está implicado en la resistencia a antimonio mediante un incremento de su eflujo al exterior celular, probablemente acomplejado con tioles. Adicionalmente, hemos confirmado que la ausencia de este transportador provoca defectos en la infectividad del parásito y también en el proceso de autofagia mediante su implicación en el metabolismo de los tioles. Finalmente, nuestros resultados presentan a LABCG2 como el primer transportador de tioles no conjugados en Leishmania.