Estudio de lípidos aislados de microalgas y polifenoles en modelos inflamatorios de piel
- Autores: Azahara María Rodríguez Luna
- Directores de la Tesis: Elena María Talero Barrientos (dir. tes.), Francisco Javier Ávila Román (dir. tes.), Virginia Motilva Sánchez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Número de páginas: 254
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Carmen Terencio Silvestre (presid.), Rocío de la Puerta Vázquez (secret.), Concepción Peiró Vallejo (voc.), Stefano Fiorucci (voc.), Javier J. Domínguez Cruz (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Farmacia por la Universidad de Sevilla
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
La piel es el principal órgano que actúa como defensa frente a agresiones externas, protegiendo al organismo de sustancias tóxicas, daño físico, e invasión por patógenos o radiaciones, suponiendo una pieza indispensable del sistema inmunológico. En este sentido, la perturbación de su estructura o función podría estar causada tanto por factores externos, como sustancias tóxicas o radiación ultravioleta (UV), o por factores internos, como pueden ser la predisposición genética, desórdenes inmunitarios u hormonales, o estrés. Como resultado de estas alteraciones, se puede desencadenar una respuesta inflamatoria, una disminución de la respuesta inmune o un daño oxidativo, entre otros.
La exposición crónica de la piel a la luz UV induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como una respuesta inflamatoria, la cual juega un papel importante en el fotoenvejecimiento, en el desarrollo de lesiones pre-cancerosas, como la queratosis actínica, y en el cáncer de piel. Por otro lado, las enfermedades inflamatorias de la piel tienen un alto impacto en la calidad de vida de los pacientes; una de ellas es la psoriasis, enfermedad crónica mediada por el sistema inmune, de afectación predominantemente cutánea, cuya patogénesis no está clara aún. Hoy en día, las estrategias para la protección de la piel se centran en el uso de compuestos naturales para contrarrestar el estrés oxidativo y la inflamación. En los últimos años, las microalgas han emergido como fuente de compuestos bioactivos, incluyendo lípidos, proteínas, polisacáridos y carotenoides. Estos compuestos han atraído el interés de la industria farmacéutica y cosmética en base a sus actividades como antioxidantes, anti-inflamatorios y anti-carcinogénicos.
En este estudio, hemos evaluado la actividad biológica de ciertos glicolípidos y el carotenoide fucoxantina, aislados de la especie Isochrysis galbana, así como del polifenol ácido rosmarínico, en diferentes modelos inflamatorios de piel tanto in vitro como in vivo, los cuales están desarrollados en los siguientes párrafos.
En primer lugar, hemos evaluado la actividad citotóxica, antioxidante y fotoprotectora de diferentes glicolípidos aislados de la microalga Isochrysis galbana, empleando un modelo in vitro de queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. El pre-tratamiento de los queratinocitos con compuestos puros con estructuras de monogalactosil-monoacilgliceroles (MGMGs) y digalactosildiacildigliceroles (DGDGs), así como las fracciones ricas en monogalactosil-diasilgliceroles (MGDGs) o DGDGs redujeron significativamente el daño celular inducido por UVB, mediante la disminución de la liberación de LDH, ROS y la producción de IL-6. Este estudio preliminar nos permitió la selección de los compuestos más activos, que fueron la fracción de glicolípidos MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, para su estudio posterior en modelos in vivo(Capítulo 1).
En el primer modelo in vivo, se estudiaron la fracción MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, en un modelo de hiperplasia epidérmica inducida TPA en ratones Swiss CD-1. Son numerosas las evidencias que muestran que la exposición de la piel a un activador de la proteína kinasa C, como es el 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), induce una respuesta pleiotrópica en el tejido, dando lugar al desarrollo de lesiones macroscópicas como descamación y eritema, lo cual se asemeja al fenotipo aparente de la psoriasis. En primer lugar, examinamos los efectos anti-inflamatorios de la aplicación tópica de MGDG y MGMG-A, disueltos en acetona (10 μg/μL, 200 μg por zona), comparándolos con la Dex como compuesto de referencia. Los tratamientos se aplicaron en un área delimitada de 1 cm2 en el dorso de los ratones y después de 30 minutos, se aplicó tópicamente el TPA (disuelto en acetona a 2 nmol por zona), en las mismas áreas durante 3 días. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con los glicolípidos disminuyó el edema, el espesor de la epidermis y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-17.
Sin embargo, es sabido que la aplicación tópica de compuestos requiere una adecuada incorporación de las moléculas bioactivas en una fórmula que ofrezca estabilidad, que permita la permeación y que permanezca el suficiente tiempo en la piel. En este sentido, desarrollamos diferentes estudios de permeación in vitro, ex vivo e in vivo, para comparar el perfil de tres formulaciones diferentes (gel, pomada y crema). Los estudios in vitro y ex vivo se desarrollaron en células de Franz y se completaron con un estudio de permeabilidad in vivo, usando gel, pomada y crema con rodamina, lo que permitió evaluar la estabilidad de las formulaciones y las propiedades de permeación de las mismas a través de las capas de la piel. Los estudios de permeabilidad mostraron que la crema era la formulación con el mejor perfil de permeación. Por tanto, estos resultados nos llevaron a evaluar una crema que contenía la fracción MGDG (MGDG-crema) (0.2 % p/p), en el modelo de hiperplasia en ratón, comenzando esta vez el tratamiento 2 días antes de la primera aplicación de TPA. En concordancia con la actividad anti-inflamatoria demostrada in vitro con esta fracción, la aplicación de la crema disminuyó el edema provocado por el TPA, mejoró los daños histopatológicos y redujo el infiltrado celular. Cabe destacar que estos resultados fueron más significativos con la aplicación de la crema que con la fracción disuelta en acetona. Además, esta formulación inhibió la expresión epidérmica de COX-2 de manera similar, alcanzando niveles similares a la Dex. Por tanto, nuestros datos muestran por primera vez el efecto preventivo de los glicolípidos en patologías inflamatorias de la piel como la psoriasis y sugieren que la fracción formulada en crema podría ser una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento de esta patología (Capítulo 2).
El siguiente estudio nos condujo a la evaluación del efecto anti-inflamatorio, antioxidante y fotoprotector del carotenoide fucoxantina (FX) aislado de Isochrysis galbana en modelos tanto in vitro como in vivo. En primer lugar, la actividad anti-inflamatoria fue evaluada en macrófagos THP-1 estimulados con LPS y en queratinocitos HaCaT estimulados con TNF-α y la actividad antioxidante en queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (50 mJ/cm2). Nuestros resultados mostraron una disminución de las citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-6, así como un efecto protector de la FX, debido a la reducción de la producción intracelular de ROS y LDH.
Estos datos nos llevaron a evaluar el posible efecto preventivo de la FX en dos modelos in vivo: un modelo de hiperplasia epidérmica inducida por TPA en ratones Swiss CD-1, y un modelo de eritema agudo inducido por UVB en ratones sin pelo SKH-1, expuestos a una irradiación de 360 mJ/cm2. Con el objeto de evitar los efectos negativos derivados del uso de disolventes como la acetona y de aumentar la permeabilidad de la FX a través de la piel, se formuló una crema que contenía el carotenoide (FX-crema) para su aplicación a los animales (0.2 % p/p). Los resultados del modelo de TPA mostraron que el pre-tratamiento con la FX-crema efectivamente mejoraba la hiperplasia en ratón inducida por TPA, reduciendo significativamente el edema de la piel, el espesor de la epidermis y la actividad de la MPO, así como la expresión epidérmica de los niveles de COX-2. Por otro lado, los datos obtenidos del modelo de exposición a UVB demostraron que la FX-crema reducía el eritema inducido por UVB en ratón, así como el edema y la actividad MPO. Además, la crema con el carotenoide inhibió la expresión de COX-2 en la piel expuesta a UVB, así como aumentó la expresión de la proteína antioxidante HO-1, a través de la regulación de la vía del Nrf2.Los resultados obtenidos en todos los estudios realizados con la FX sugieren que este carotenoide, vehiculizado en una formulación tópica para mejorar su permeación, podría suponer una estrategia novedosa para prevenir las exacerbaciones asociadas a la psoriasis y proteger a la piel de la radiación UV(Capítulo 3).
En relación a los estudios con compuestos naturales, las plantas siguen siendo hoy en día uno de los campos más prometedores para el descubrimiento de nuevos compuestos que pueden conducir al desarrollo de fármacos. En este sentido, los polifenoles son uno de los grupos más estudiados; estos compuestos son metabolitos secundarios de las plantas y generalmente, participan en los mecanismos de defensa de éstas contra agresiones externas. Con más de 8.000 estructuras diferentes conocidas, tienen como base común la presencia de uno o más grupos fenólicos. La actividad anti radicales libres de esta familia de compuestos ha sido ampliamente descrita, de hecho son los antioxidantes más potentes que consumimos en nuestra dieta. Sin embargo, la investigación en torno a ciertas propiedades todavía continúa en desarrollo. En este sentido, la actividad antiinflamatoria es una de las más importantes. Por lo tanto, en nuestro siguiente estudio evaluamos el efecto de un compuesto polifenólico, el ácido rosmarínico (RA) en un modelo de psoriasis inducida por Imiquimod (IMQ). El IMQ es un agonista de los receptores Toll-like 7 y 8, cuya aplicación tópica en el dorso de ratones Balb/c durante 6 días, induce una inflamación acompañada de alteraciones típicas de la psoriasis. Debido a que la efectividad del RA aplicado por vía tópica puede ser limitada por su baja liposolubilidad y estabilidad, así como su facilidad para oxidarse o degradarse con la luz, hemos usado nanoliposomas (NL) para encapsular dicho polifenol. El pre-tratamiento tópico con RA en gel y RA encapsulado en NL disueltos en gel (ambos a 0.2 % p/p) 30 minutos antes de la aplicación del IMQ (62.5 mg por zona durante 6 días consecutivos) inhibió el daño macroscópico y el peso del punch obtenido de la piel afectada, sugiriendo la reducción del edema de la piel, la infiltración neutrofílica, la actividad de la MPO y la expresión de citocinas pro-inflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-17. El RA en gel mostró mejores resultados que el RA encapsulado en NL, esto podría ser debido a que la constante de disociación (pka) del RA a pH fisiológico afecta a la liberación de este compuesto desde los NL al medio celular, y consecuentemente, reduce su actividad biológica. En este sentido, al confirmar que la estructura química del RA influye en la actividad final de la formulación, sería necesaria una encapsulación específica para este tipo de compuestos.
Contribuyendo con estos resultados al uso de estos sistemas en la industria farmacéutica, puesto que suponen una esperanzadora herramienta como sistemas de liberación de fármacos vía tópica, debido a su efectividad para favorecer la permeación y llevar el fármaco hasta ciertas zonas de la piel (Capítulo 4).
Por último, evaluamos un posible sinergismo entre los principales compuestos empleados en esta tesis, FX y RA. Para ello, se ensayaron en un modelo de queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (100 mJ/cm2) con el objetivo de elucidar su mecanismo de acción y determinar si una mezcla de los mismos (5 μM de FX + 5 μM de RA) podría mejorar sus actividades biológicas. En este estudio se determinó la viabilidad celular, el ciclo celular, y la inducción de apoptosis, así como se evaluaron mediadores implicados en la activación del inflamasoma. La mezcla de estos compuestos demostró un mejor efecto fotoprotector y antioxidante que los compuestos por separado, disminuyendo la muerte celular, con el consecuente aumento de la viabilidad celular, y reduciendo la apoptosis y los niveles de ROS inducidos por la acción del UVB. Además, la mezcla moduló la respuesta inflamatoria disminuyendo la expresión de los componentes del inflamasoma como son el NLRP3 y ASC, y aumentando la expresión de los niveles de la proteína antioxidante HO-1, mediante la regulación de la vía del Nrf2(Capítulo 5).
En conclusión, nuestros estudios in vitro e in vivo han demostrado los efectos beneficiosos de varios productos naturales, entre los que destaca la FX y el RA, en enfermedades de base inflamatoria, asociadas tanto a la exposición UVB como a patologías mediadas por el sistema inmune como la psoriasis. Sus mecanismos de acción podrían estar envueltos en la prevención del estrés oxidativo a través de la activación de la vía Nrf2 y la reducción de la inflamación mediante la regulación del inflamasoma y otras citocinas relacionadas con la vía del NF-κB. Por esta razón, estos compuestos podrían suponer moléculas prometedoras para su posible incorporación en productos para el cuidado de la piel como por ejemplo protectores solares, cremas anti-edad o regeneradoras, o formulaciones tópicas para el tratamiento de patologías inflamatorias como la psoriasis.
