Estudio de los efectos de la aplicación de un campo magnético alterno sobre células cargadas con nanopartículas magnéticas de óxido de hierro utilizando diferentes aproximaciones experimentales

• Autores: Patricia Hernández Flores
• Directores de la Tesis: Domingo F. Barber Castaño (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Número de páginas: 154
• Tribunal Calificador de la Tesis: Pilar Herrasti González (presid.), Mario Mencía Caballero (secret.), David Pozo Pérez (voc.), María del Puerto Morales Herrero (voc.), Jesús Martínez de la Fuente (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Física
    • Electromagnetismo
      • Magnetismo
  • Ciencias de la vida
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    La hipertermia magnética (MHT, del inglés magnetic hyperthermia) consiste en aumentar selectivamente la temperatura de tejidos tumorales previamente cargados con nanopartículas magnéticas (MNP, del inglés magnetic nanoparticles) capaces de liberar calor en respuesta a la aplicación de un campo magnético alterno (AMF, del inglés alternating magnetic field) en el rango de la radiofrecuencia. A pesar de la amplia investigación realizada en el campo, no hay un consenso unánime acerca del mecanismo desencadenante de los efectos inducidos por este tipo de tratamiento a nivel celular.

    Para estudiar si los efectos mediados por MNP localizadas intracelularmente y expuestas a un AMF son causados por la disipación de calor o se producen por mecanismos independientes del calor, realizamos experimentos in vitro de MHT utilizando células Pan02 y MNP de diferentes tamaños de núcleo (6 nm, 8 nm o 14 nm) recubiertas con aminopropilsilano (APS-MNP). Suspendidas en agua, estas MNP producían cantidades crecientes de calor en presencia de un AMF de 250 kHz y 25 kA/m (medido según el voltaje pico-pico). A pesar de su distinta capacidad para producir calor, los tres tamaños de MNP redujeron la viabilidad celular de una forma similar. La comparación de los niveles del mRNA de Hsp70 (aumentada en condiciones de estrés, incluido el estrés por calor) mostró una expresión aumentada no solo por las células cargadas con las MNP, sino también por las muestras control expuestas del mismo modo al AMF pero no cargadas con las MNP.

    Este resultado nos permitió advertir que la propia bobina generadora del AMF suponía una fuente externa de calor. Para estudiar el efecto real de la exposición al AMF, realizamos unos ajustes en el equipo generador del AMF con el fin de controlar la temperatura del medio de cultivo durante su aplicación. Posteriormente, repetimos los experimentos in vitro de MHT, en este caso con las APS-14 nm-MNP, o con MNP del mismo tamaño, pero recubiertas con ácido dimercaptosuccínico (DMSA), y utilizando tres aproximaciones experimentales diferentes. Para analizar el efecto del empaquetamiento de las MNP en el interior celular, realizamos los experimentos con las MNP localizadas bien intracelularmente (células Pan02) o bien en la membrana celular (células Jurkat) y manteniendo la temperatura del medio de cultivo a 37 ºC; y para estudiar el efecto cooperativo del calor externo, mantuvimos la temperatura del medio de cultivo a 41 ºC, 43 ºC o 45 ºC y con las MNP localizadas intracelularmente. En estas nuevas condiciones experimentales no se reprodujeron ninguno de los efectos observados previamente. Por último, analizamos las propiedades magnéticas de las MNP en los diferentes entornos celulares estudiados anteriormente y observamos que el contacto de las MNP con las células condujo a su agregación, influyendo en su respuesta magnética. Estos resultados podrían explicar en parte la ausencia de efectos a nivel celular en los experimentos in vitro de MHT en las condiciones experimentales llevadas a cabo en esta tesis doctoral.

  • English

    Magnetic hyperthermia (MHT) is the selective temperature increase in tumour tissues preloaded with magnetic nanoparticles (MNP) that are able to release heat in response to the application of an alternating magnetic field (AMF) in the radiofrequency range. Despite much research, there is no consensus about the mechanism as to how this treatment causes effects in cells.

    To test whether the effects mediated by intracellular MNP exposed to an AMF are caused by heat dissipated by the MNP or by heat-independent mechanisms, in vitro MHT experiments were carried out on Pan02 cells loaded with aminopropylsilane-coated MNP (APS-MNP) with different core sizes (6 nm, 8 nm or 14 nm). Dispersed in water, these MNP produce increasing amounts of heat in the presence of an AMF (250 kHz, 25 kA/m (measured according to peak-to-peak voltage)). Despite their different heat-producing abilities, all three MNP reduced cell viability similarly. Comparison of mRNA Hsp70 expression levels (increased in stress conditions, including heat stress) showed an increased expression not only in MNP-loaded cells but also in non-loaded control samples when exposed to the AMF. This result lead to the fact that the coil that was used to generate the AMF was an external heat source itself. To study the real effect of the exposure to the AMF, some adjustments were made in the AMF applicator so as to control the culture medium temperature during the application of the AMF. The in vitro MHT experiments were subsequently repeated, now with the APS-14 nm-MNP, or with MNP of the same size but coated with dimercaptosuccinic acid (DMSA), and using three different experimental approaches. To analyze the effect of MNP confinement inside the cells, MHT experiments were carried out with the MNP located either inside the cells (Pan02 cells) or in the cell membrane (Jurkat cells) and maintaining the culture medium temperature at 37ºC; and to study the cooperative effect of external heat, the culture medium temperature was maintained at 41ºC, 43ºC or 45ºC with the MNP located inside the cells. In the conditions of these new experimental settings, none of the previously observed effects were found. Finally, the magnetic properties of the MNP in the previously studied cellular environments were studied and it was observed that the simple fact of being in contact with the cells makes the nanoparticles aggregate, which affects their magnetic response. These results may explain the absence of effects at the cellular level in the in vitro MHT experiments in the experimental conditions carried out in this doctoral thesis.