Resumen de Nuevos antibacterianos basados en enzimas líticas de la pared celular de Streptococcus mitis y Streptococcus pneumoniae
- español
Las endolisinas fágicas y las autolisinas bacterianas representan una nueva clase de antimicrobianos (denominados también enzibióticos) gracias a su capacidad para hidrolizar el peptidoglicano de forma rápida y, generalmente, específica de especie. La endolisina Skl está codificada por el bacteriófago ΦSK137 de Streptococcus mitis, un patógeno oportunista estrechamente relacionado con Streptococcus pneumoniae. Skl consta de un módulo catalítico (familia CHAP amidasa) y un módulo de unión a colina (CBM) que se une a la pared bacteriana y que comparte un 64 % de secuencia con el CBM de la principal autolisina de neumococo (LytA), cuyo módulo catalítico pertenece a la familia Amidasa_2. El estudio comparativo de ambas enzimas mediante diferentes aproximaciones biofísicas y bioquímicas ha mostrado que Skl tiene menor afinidad por colina que LytA, requiere concentraciones de colina mucho mayores para formar dímeros, y presenta una escasa actividad bactericida contra S. pneumoniae a concentraciones en las que LytA mata eficientemente a este patógeno. Estos resultados indican que su distinta capacidad como enzibióticos podría ser debida, no solo a la distinta actividad intrínseca de los módulos catalíticos, sino a las diferencias de secuencia de sus CBMs.
Según esta hipótesis, la sustitución del CBM de Skl por el de LytA aumentaría tanto la afinidad por colina como la capacidad de dimerización y la actividad bacteriolítica en la quimera resultante (QSLA2) en comparación con Skl silvestre. Por el contrario, la sustitución equivalente en LytA (lisina quimérica QLAS1) debería disminuir estas capacidades con respecto a LytA. Las quimeras QLAS1 y QSLA2 se contruyeron a partir de los genes de las enzimas parentales Skl y LytA, por intercambio de las regiones que codifican los respectivos módulos manteniendo el “linker” que conectaba el módulo catalítico al CBM en la lisina parental. Su aislamiento, con elevado rendimiento, y posterior caracterización ha permitido demostrar la relevancia de esos factores para la actividad bactericida. QSLA2, portadora del módulo catalítico de Skl y el CBM de LytA, mata más eficazmente y a menor concentración que LytA todas las cepas de S. pneumoniae y S. mitis ensayadas, incluidos aislados clínicos multirresistentes que no son susceptibles a la actividad de LytA. Por el contrario, QLAS1, que comprende el módulo catalítico de LytA y el CBM de Skl, carece de actividad bactericida sobre S. pneumoniae, a pesar de que su actividad sobre paredes purificadas es comparable a la de QSLA2. Además, QSLA2 es capaz de proteger a embriones de pez cebra frente a la infección con S. pneumoniae, lo que hace de ella un prometedor antimicrobiano contra las infecciones provocadas por neumococo. Nuestros resultados proporcionan también nuevas claves sobre el papel que juegan los CBMs, así como la combinación de módulos, en el potencial antimicrobiano de las lisinas de neumococo y otras especies afines, y podrían utilizarse tanto para mejorar o modular la actividad como para diseñar nuevos enzibióticos.
- English
Phage endolysins and bacterial autolysins represent a novel class of antimicrobials (known also as enzybiotics) against bacteria due to their unique ability to cleave rapidly the peptidoglycan in a generally species-specific manner. The Skl endolysin is encoded by the ΦSK137 bacteriophage of Streptococcus mitis, an opportunistic pathogen closely related to Streptococcus pneumoniae. It comprises an N-terminal catalytic module (CHAP amidase family) and a C-terminal choline-binding module (CBM), involved in cell wall-attachment, that shares 64 % of sequence with the CBM of LytA, the major pneumococcal autolysin, whose catalytic module belongs to the Amidase_2 family. The comparative study of both amidases using different biophysical and biochemical techniques here reported has revealed that Skl has less affinity for choline than LytA, requires much higher concentrations of choline to form dimers, and displays a poor bacteriolytic activity against S. pneumoniae under conditions where LytA efficiently killed this pathogen. These results were indicative that their distinct capacity as enzybiotics could result, apart from dissimilar intrinsic activities of the catalytic modules, from sequence differences in their CBMs.
If this were the case, replacement of the CBM of Skl by that of LytA would improve the choline binding affinity, the dimerization capacity and the bacteriolytic activity of the resulting chimeric lysin (QSLA2) in comparison to Skl wild type. By contrary, the equivalent substitution in LytA (chimeric lysin QLAS1) should depress these capacities with respect to LytA. The QLAS1 and QSLA2 chimeras were built from the genes of the parental enzymes by swapping the regions encoding the respective modules while preserving, in both constructions, the linker connecting the catalytic module to the CBM in the parental enzyme. The chimeric lysins showed high expression levels, which allowed their structural and functional characterization. As expected, QSLA2 showed higher choline affinity and dimerization ability than Skl and its antimicrobial activity was significantly improved in comparison to both Skl and LytA. Indeed, QSLA2 efficiently killed at very low concentration all the strains of S. pneumoniae and S. mitis tested, including multiresistant clinical isolates non-susceptible to LytA hydrolytic activity. By contrary, QLAS1, that comprises the catalytic module of LytA and the CBM of Skl, showed no bacteriolytic activity against S. pneumoniae and its choline binding features approached those exhibited by the Skl endolysin, in agreement, again, with the initial hypothesis. Of note, the lytic activity of QLAS1 on purified cell walls is comparable to that of QSLA2. Also, QSLA2 is able to protect zebrafish embryos from S. pneumoniae infection, which makes it a promising antimicrobial agent to treat pneumococcal infections. Taken together, our results provide new clues on the role played by the CBM and the module combination in the antimicrobial potential of this family of lysins, that could be useful to improve or modulate their activities, as well as to design new enzybiotics.
