Caracterización de la interacción patógeno-garrapata mediante genómica funcional y proteómica
- Autores: Nieves Ayllón
- Directores de la Tesis: Margarita M. Villar Rayo (codir. tes.), José de la Fuente García (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ricardo Pérez Sánchez (presid.), Isabel García Fernández de Mera (secret.), Ana Isabel Amaro Gonçalves Domingos (voc.)
- Materias:
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- Resumen
INTRODUCCIÓN El aumento del uso de la tierra por parte del hombre a través de la ganadería y la agricultura, así como por sus actividades recreativas en la naturaleza, ha incrementado la incidencia de enfermedades transmitidas a través de la picadura de artrópodos hematófagos como son las garrapatas [1]. Anaplasma phagocytophilum, agente causante de la anaplasmosis granulocítica humana (HGA), es uno de los patógenos transmitidos por garrapata que afecta a un amplio rango de hospedadores vertebrados incluyendo el ser humano, y considerado uno de los más importantes en Estados Unidos, Europa y Asia por el aumento del número de afectados cada año. El responsable principal de esta transmisión es la garrapata del género Ixodes, siendo Ixodes scapularis el principal transmisor de Anaplasma phagocytophilum en Estados Unidos afectando fundamentalmente a humanos [2].
Como se ha demostrado en otros trabajos anteriores, existen evidencias de que Anaplasma phagocytophilum regula procesos biológicos tanto en células humanas como en garrapatas con el objetivo de favorecer su propio proceso infectivo. Estas regulaciones se basan en alteraciones a nivel molecular (como son modificaciones a nivel de genes, de proteínas, de vías metabólicas, modificaciones en el citoesqueleto, etc) que A. phagocytophilum provoca en la célula huésped con el fin de mejorar su replicación y su transmisión [1, 3, 4], así como de evadir la respuesta defensiva que la célula hospedadora ejerce frente a la infección. Por este motivo, el objetivo de esta tesis ha consistido en estudiar la interacción patógeno-garrapata centrándonos en tres procesos biológicos que se consideran puntos clave en la respuesta frente a la infección: muerte celular programada (apoptosis), respuesta inmune y respuesta al estrés celular.
CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN La apoptosis o muerte celular programada es el proceso ordenado por el que la célula termina muriendo tras la aparición de estímulos nocivos extra o intracelulares entre los que se encuentra la infección. Debido a los efectos adversos de la apoptosis sobre la replicación y diseminación de los agentes patógenos, muchos de ellos han desarrollado estrategias para bloquear la apoptosis de la célula infectada [5, 6]. A través de los análisis transcriptómicos, proteómicos y funcionales llevados a cabo en esta tesis, se ha comprobado que la infección por A. phagocytophilium desencadena un cambio en la organización del citoesqueleto y en la regulación del proceso de apoptosis en las células de garrapata con el propósito de establecer y mejorar el proceso infectivo. Se ha demostrado que en el intestino de la garrapata, la infección por A. phagocytophilium promueve la inhibición del proceso apoptótico a través de la alteración de la vía de señalización celular denominada JAK-STAT. Por el contrario, en las glándulas salivares, dicha inhibición se consigue a través de la regulación de la vía intrínseca de la apoptosis en la que se promueve la disminución de la expresión de una Porina mitocondrial que, a su vez, altera la liberación de Citocromo C y desencadena una respuesta anti-apoptótica en la célula. Al mismo tiempo, las glándulas salivares participan en la activación de la vía extrínseca de la apoptosis como mecanismo de protección de la garrapata para limitar la supervivencia del agente patógeno. Estos resultados proponen que A. phagocytophilium utiliza diferentes estrategias de regulación de la ruta apoptótica dependiendo del tejido de la garrapata en el que se encuentre, y que estas estrategias utilizadas para establecer su infección son similares tanto en hospedadores vertebrados como en invertebrados. Otro proceso biológico que ha sido sometido a estudio en este trabajo por estar involucrado en el proceso infectivo es la respuesta inmune. Esta respuesta de defensa permite a los individuos sobrevivir al contacto con diferentes tipos de patógenos. El gen de la subolesina, ortólogo de las akirinas de insectos y vertebrados, se ha considerado un gen involucrado en la respuesta inmune y además se ha demostrado estar regulado por el factor nuclear NF-kB, factor regulador de la transcripción de genes relacionados con la respuesta inmune [7, 8]. En esta tesis se demuestra la interacción entre subolesina y NF-kB y, además, a través de un ensayo de silenciamiento génico, se observa cómo la regulación entre ambos genes se produce de manera recíproca. Por otra parte, se ha demostrado que la infección por A. phagocytophilium favorece la unión de NF-kB al promotor del gen de la subolesina con el fin de activar su expresión. Este resultado se ha corroborado utilizando ensayos de citometría de flujo donde se muestra un aumento en la síntesis a nivel de proteínas tanto de subolesina como de NF-kB en respuesta a la infección. En su conjunto, estos resultados ratifican la regulación de subolesina por NF-kB en Ixodes scapularis, y muestran cómo la garrapata hace frente a la infección por A. phagocytophilium activando su respuesta inmune a través de la activación del gen de la subolesina, o bien lo que puede estar ocurriendo es que el patógeno esté activando la expresión de ambos genes (subolesina y NF-kB) con el objetivo de promover la regulación de la transcripción de genes que él necesita para su proceso infectivo.
Un tercer proceso biológico estudiado en esta tesis con relación a la infección por A. phagocytophilium es la respuesta al estrés celular. Tanto el choque térmico, como la toxicidad y/o la infección, ocasionan situaciones de estrés celular que serían críticas en la supervivencia de las células si no fuera por la presencia de proteínas de respuesta al estrés, entre las que se encuentran las proteínas de choque térmico (HSPs), que intervienen en la protección de posibles daños celulares consecuencia de estas situaciones de estrés [9, 10]. Algunos trabajos de esta tesis se centran en el análisis proteómico, transcriptómico y funcional realizados en Ixodes scapularis con el objetivo de conocer aquellas proteínas relacionadas con la respuesta al estrés ocasionada por diferentes factores entre los que se encuentra la infección. Frente a la infección por A. phagocytophilium, se ha demostrado que las proteínas de estrés térmico HSP70 y HSP20 juegan un papel en el proceso infectivo a través de su inducción e inhibición, respectivamente. Además, a partir de ensayos funcionales se ha comprobado que el silenciamiento génico de hsp70 y hsp20 afecta negativamente en la alimentación de la garrapata, así como en su capacidad de búsqueda de los hospedadores vertebrados a través del ascenso por la vegetación. Es curioso observar cómo la propia alimentación de la garrapata dispara la expresión de genes que el patógeno puede utilizar en su propio beneficio, y cómo de la misma manera, el aumento de la temperatura ambiental induce igualmente la expresión de genes de respuesta a estrés que le permiten a la garrapata aumentar la velocidad de ascenso por la vegetación con el fin de encontrarse lo antes posible con el hospedador, minimizando el tiempo de exposición a la desecación. Estos resultados sugieren la existencia de una relación establecida entre las HSPs y los procesos fisiológicos de vital importancia para la garrapata. En otro trabajo relacionado con la respuesta al estrés, se realiza un estudio proteómico y transcriptómico centrándonos en el patógeno A. phagocytophilium, con el fin de estudiar aquellas proteínas del patógeno que son de mayor relevancia durante la infección en la garrapata. De este análisis se concluye que proteínas de membrana (MSP4) y proteínas relacionadas con el estrés térmico (HSP70, GroEL y SOD) no sólo se expresan de manera diferencial durante la infección sino que, además, a través de ensayos en los que se bloquean estas proteínas mediante anticuerpos específicos y de ensayos de unión a receptores, se ha comprobado que dichas proteínas intervienen en la unión patógeno-Ixodes scapularis. Estos resultados ponen de manifiesto una nueva estrategia por la que el patógeno favorece su multiplicación y transmisión a través de la activación de la respuesta al estrés que le ofrece, por una parte, la protección necesaria para hacer frente al estrés oxidativo generado en la célula hospedadora como mecanismo de defensa y, por otra parte, la mejora de su unión con ella.
Además, todos los análisis proteómicos, transcriptómicos y funcionales integrados a través de la biología de sistemas realizados en esta tesis muestran las diferencias específicas entre tejidos de I. scapularis en respuesta a la infección, reflejando el ciclo de vida dual que A. phagocytophilium desarrolla en intestino (forma replicativa) y en glándulas salivares (forma densa) de garrapata.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN Como se ha estudiado en esta tesis y como se ha demostrado en otros trabajos, en la transmisión de patógenos a través de la garrapata intervienen proteínas que bien pueden beneficiar o perjudicar el proceso infectivo a diferentes niveles como puede ser la entrada, la multiplicación y/o la transmisión del patógeno [11, 12, 13]. Todas estas proteínas son muy importantes ya que nos permiten seleccionar posibles candidatos a la hora de diseñar nuevas vacunas destinadas a bloquear la adquisición y transmisión de patógenos por parte de las garrapatas. Sin embargo, a la hora de estudiar la transmisión de patógenos por garrapatas no solamente tenemos que centrarnos en este nivel molecular, sino que además tenemos que tener en cuenta la biología y la ecología de las garrapatas.
Dado que la mayoría de las garrapatas desarrollan su ciclo de vida en hábitats abiertos, las fluctuaciones originadas en el medio ambiente suponen muchas veces factores de estrés que pueden alterar la relación patógeno-garrapata-hospedador. De esta manera, se ha comprobado que la temperatura y la humedad relativa del ambiente son factores decisivos en el desarrollo y supervivencia de la garrapata [14, 15], así como factores condicionantes en su capacidad de ascender hacia zonas más favorables de la vegetación en su búsqueda del hospedador vertebrado [16]. En definitiva, los factores abióticos (factores climáticos) se pueden considerar factores determinantes en la capacidad vectorial, es decir, la capacidad de la garrapata para mantener y transmitir agentes infecciosos hacia sus hospedadores vertebrados.
De este modo podemos concluir que, el conocimiento cada vez más exhaustivo de la relación establecida entre la garrapata y el agente patógeno transmitido por ella, nos permitirá poder ir definiendo con mayor certeza posibles moléculas candidatas claves en el desarrollo de la infección, y con ello poner en marcha el diseño de nuevas vacunas destinadas a interferir la infección y bloquear la transmisión de enfermedades por parte de las garrapatas.
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