Structural biology and characterization of the human R2TP, an HSP90 co-chaperone complex

• Autores: Hugo Muñoz Hernández
• Directores de la Tesis: Óscar Antonio Llorca Blanco (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 168
• Tribunal Calificador de la Tesis: José M. Valpuesta (presid.), Mauricio García Mateu (secret.), Rafael Fernández Leiro (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Esta tesis recoge la labor de investigación que se ha llevado a cabo en los últimos cinco años y que fundamentalmente se ha centrado en el estudio de la co-chaperona humana R2TP (hR2TP).

    Resultado de esta tesis es mejor nuestro conocimiento sobre el hR2TP. Este complejo está formado por las proteínas: RuvBL1, RuvBL2, RPAP3 y PIH1D1. El hR2TP tiene una función co-chaperona, siendo capaz de unirse a la chaperona llamada “heat shock protein 90” (HSP90) (Vaughan, 2014; Pearl, 2016). Los mecanismos por los cuales el R2TP humano es capaz de llevar a cabo la correcta activación y el ensamblaje de otros complejos fundamentales a nivel celular son todavía desconocidos.

    La primera vez que se describió el complejo R2TP fue en la levadura Saccharomyces cerevisiae. En este organismo aparece formado por: Rvb1p, Rvb2p, Tah1p y Pih1p y de ahí su nombre (R2TP) (Zhao et al, 2005). El R2TP tiene una gran importancia celular. Se encuentra involucrado en múltiples procesos biológicos incluyendo la biogénesis de la caja C/D de las ribonucleoproteinas nucleolares pequeñas (snoRNP), apoptosis, maduración de las quinasas similares a las fosfatidilinositol-3-quinasas (PIKK) y el ensamblaje de la RNA polimerasa II (Kakihara & Houry, 2012). Actualmente se desconocen los mecanismos de actuación por los cuales el R2TP lleva a cabo las funciones de activación y regulación de los procesos celulares en los que participa.

    Como objetivo de estudio nos propusimos definir la organización estructural tridimensional (3D) del complejo hR2TP. Así como, proporcionar una visión más detallada de los mecanismos de unión a HSP90 y que estabilizan la asociación del complejo chaperona/co- chaperona.

    21En este trabajo se analizó bioquímica y estructuralmente el hR2TP y se propusieron modelos de acción celular de dicho complejo.

    En primer lugar, se produjeron los sub-complejos RuvBL1-RuvBL2 y RPAP3-PIH1D1 por separado. Ambos complejos se purificaron y analizaron en detalle. Dichas preparaciones, de alta pureza, se utilizaron para reconstituir in vitro el hR2TP. Los principales métodos bioquímicos utilizados para la caracterización y el análisis de las proteínas, fueron ensayos de interacción por afinidad, filtración en gel, gradiente de sacarosa y fijación con glutaraldehído.

    Posteriormente, el hR2TP ensamblado se analizó por crio- microscopia electrónica. Mediante el procesamiento de las imágenes del hR2TP ha sido posible resolver la estructura tridimensional del mismo alcanzando una resolución promedio de 4.3 Å. De la estructura se puede determinar que las proteínas RuvBL1 y RuvBL2 forman una plataforma para el anclaje de RPAP3-PIH1D1. Estas ultimas son fundamentales en el proceso de reclutamiento de la chaperona HSP90, que es la que finalmente da lugar a la activación y maduración de complejos fundamentales en diversos procesos celulares.

    El resultado de este trabajo es que gracias a la caracterización estructural a alta resolución del complejo hR2TP hemos podido mejorar nuestro conocimiento sobre los procesos celulares que rigen la maduración de PIKKs, telomerasa y el ensamblaje de RNA polimerasa II entre otros.

    PALABRAS CLAVE R2TP, RuvBL1, RuvBL2, RPAP3, PIH1D1, HSP90, PIKKs, chaperona, bioquímica, estructura, función, crio-microscopia electrónica