Resumen de Observaciones citopatogénicas en los cultivos de fibroblastos de embrión de pollo
Siendo la célula y el medio en que vive los fundamentos de este trabajo, parece obligado en la introducción hacer un bosquejo histórico de ambos conceptos, de los que nunca mejor que ahora se ha podido hablar con tanta precisión de su complejidad. Los portentosos avances técnicos han permitido ir descifrando poco a poco los más intricados problemas biológicos, hasta llegar a facilitar en nuestros días una visión precisa de la gran complejidad de los organismos vivos, y más en particular de la célula y del medio que ésta vive. Los estudios estructurales y citológicos, por un lado, y los puramente fisiológicos y bioquímicos, por otro han permitido ir penetrando en los secretos de la vida hasta llegar a la descifrar algunos de los problemas más complejos.
Tendríamos que retroceder al menos unos trescientos años para tratar de adquirir conciencia de lo que fue la organización de la base del complicado edificio que corresponde a lo que hoy se conoce sobre la estructura celular, así la aplicación del microscopio al examen de los seres vivos permitió descubrir, en el curso de los siglos XVII, XVIII y XIX, que todos ellos, el hombre, los animales y las plantas están formados por la asociación de organismos elementales sumamente pequeños, dotados de vitalidad propia: las células.
La primera descripción de la estructura celular de las plantas se debe al inglés HOOKE (1635), quién observó en el corcho y otros tejidos vegetales pequeñas cavidades de forma poliédrica, que llamó “cells” (celdillas; en latín células), por su semejanza con las celdillas de un panal.
Aún cuando HOOKE había ya observado que estas cavidades estaban llenas de un “jugo nutricio” (succus nutritus), fueron MALPIGIO y GREW (1675), los que utilizando lentes de poco aumento describen de forma más completa el contenido de dichas cavidades, en cuyo interior además del jugo nutricio se encontraban espirales y vasos, observaciones que les valieron a ambos el título de fundadores de la anatomía microscópica de los vegetales.
Los progresos en el conocimiento de la célula se iniciaron cuando Robert BRUWN (1833) descubrió el núcleo de las células vegetales y lo consideró como un elemento constitucional de la célula “que probablemente tendría gran importancia”. La intuición de BRUWN se confirmaría con los años, hasta constituir una ciencia dentro de la biología. Su importancia en la génesis celular fue señalada por SCHLEIDEN, (1838), distinguiendo con SCHWANN (1839) dos formas principales de generación celular, una endógena por aparición de nuevas células en el interior de otras antiguas, y otra exógena por aparición de núcleos de novo, la primera sería más frecuente en los vegetales y la segunda en los animales.
SCHWANN admitia más, que las células nacían en el seno de los tejidos por una especie de “generatio aequivoca”. En el seno del “blastema”, sustancia homogénea o finamente granulosa, surgía en primer término el núcleo por un proceso semejante a la cristalización, precipitándose en torno suyo la sustancia que iba a transformarse en membrana nuclear; cuando el núcleo hubiera alcanzado un cierto grado de desarrollo, la célula se formaría en torno suyo.
El núcleo era definido como un corpúsculo con una membrana y un contenido homogéneo en el que estaban en suspensión varios nucléolos (KOLLIKER, 1880).
Al contenido celular se le denominó protoplasma (HUGO VON MOHL 1837), a su estudio se dedicaron varios nuevos investigadores, entre los que hay que destacar a MAX SCHULTZE (1861), quien definió la célula como un granito de protoplasma en cuyo interior se encuentra el núcleo. En esta definición, la membrana celular tan importante para SCHLEIDEN y SCHWANN y a la que había dedicado la máxima atención, queda eliminada por entero; la teoría celular de estos autores se convierte en la “teoría protoplasmática”. Podemos decir, por tanto, que una planta o un animal no es otra cosa, desde el punto de vista de su constitución, que una masa de materia viva formada por infinidad de masitas protoplasmáticas dotadas cada una de su correspondiente núcleo y rodeadas o no de la correspondiente membrana.
La célula es, por tanto, la unidad anatómica del organismo. Es también la unidad fisiológica de los seres vivos, pues la vitalidad de estos en la suma coordenada de la vitalidad de las células integrantes.
Al decir que la vitalidad de un organismo es la suma coordenada de la vitalidad de células integrantes quiere decirse que un ser pluricelular no debe considerarse como una colonia de unidades elementales independientes. Un ser pluricelular tiene una “unidad orgánica” indiscutible. El todo orgánico es algo más que la simple suma de sus partes componentes. Se le puede considerar como una masa protoplásmatica unitaria que en el curso de la ontogenia se va diferenciado en células.
Una serie de hechos prueban que la célula es el organismo elemental:
1. Existen, además de seres pluricelulares, constituidos por numerosas células, seres unicelulares, formados por una sola.
2. Las células no se forman “de novo” sino que proceden de otras células anteriores mediante el fenómeno de reproducción.
Para SCHLEIDEN y SCHWANN, las células se formaban libremente por un proceso parecido al de la cristalización; primeramente aparecía el nucléolo y a su alrededor se formaría el núcleo, el cuerpo celular y la membrana. Fue REMAK (1841) el primero en intuir que las células proceden de la división de otras células, aunque VIRCHOW (1843) le diera carácter de doctrina que resumiera en su pragmática frase “Omnis cellula e cellula”.
3. Los gérmenes de los seres vivientes, esporas, huevos, son células y el organismo pluricelular se organiza a partir de la célula germen por sucesivas biparticiones. Estas células, al principio son semejantes, pero en el curso del desarrollo se van diferenciado para formar los distintos órganos y tejidos.
4. En los organismos pluricelulares cada célula conserva su individualidad y se nutre y crece por cuenta propia.
5. Finalmente y a partir de 1905, con el norteamericano HARRISON (1907) se ha demostrado que las células de un organismo pluricelular, pueden separarse del conjunto y cultivarse en medios nutritivos adecuados.
Estos son en síntesis los hechos trascendentales que constituyen los fundamentos modernos de la fructífera teoría celular ideada hace más de cien años por SCHLEIDEN y SCHWANN.
Establecidas estas bases, el biólogo celular trata ahora de explicar a la luz de los conocimientos actuales y en término moleculares lo que ve con la ayuda de sus instrumentos; se ha convertido en un biólogo molecular. El bioquímico se ha convertido en un citólogo bioquímico, interesado de igual manera por la estructura de la célula y pro actividad bioquímica en que se encuentra engranada. Los misterios de la estructura celular de su función no se pueden resolver unilateralmente con técnicas morfológicas o con técnicas bioquímicas, sino desde ambos lados simultáneamente.
El interior de la célula se distingue del mundo exterior con la presencia de moléculas muy grandes y complejas. La capacidad de sintetizar grandes moléculas a partir der otras sustancias más sencillas es una de las supremas características que distinguen a las células.
La síntesis de proteínas, a partir de unidades más sencillas de veinte aminoácidos diferentes tienen lugar bajo al regulación de DNA y del RNA, por el momento las moléculas más altamente estructuradas de todas as de la célula. Durante los últimos años, los investigadores han mostrado que el DNA, localizado en el núcleo, preside la síntesis del RNA, que se encuentra tanto en el núcleo, como en el citoplasma. El RNA a su vez, ordena los aminoácidos en la secuencia adecuada para luego ligarse dando cadenas de proteínas.
Durante el desarrollo embrionario, las células en diferenciación despliegan una cierta capacidad para reconocer a otra de su misma especie. Las células que pertenecen a la misma familia y se parecen entre sí tienden a agruparse, juntándose para formar un tejido, del cual se excluye a todas las células de otros tipos, es en esta mutua asociación y expulsión de células donde la membrana parece desempeñar un papel decisivo.
La membrana celular, que solo tiene cien unidades angstrom de grosor, y que aparece simplemente como una barrera de separación al observarla al microscopio óptico, con el microscopio electrónico se ha demostrado que tiene una complicada estructura que está claramente de acuerdo con las propiedades funcionales de la membrana, por ejemplo distinguir los iones sodio de los iones potasio. La membrana ayuda a los iones potasio a entrar en la célula y opone algo más que una barrera de permeabilidad frente a los iones sodio, además de poder introducir grandes moléculas y cuerpos microscópicos, mediante una ingestión mecánica.
Más allá de la membrana, en el citoplasma, el microscopio electrónico ha revelado la fina estructura de orgánulos, que aparecen como simples gránulos al observarlos con el microscopio óptico, son “los generadores de fuerza” de toda la vida que existe sobre la tierra. Los cloroplastos, por ejemplo que capturan la energía de la luz solar mediante la fotosíntesis y las mitocondrias extraen la energía de los enlaces químicos de los nutrientes de la célula. La energía se encuentra almacenada en los enlaces de fosfato del ATP.
Es por este método de microscopía electrónica como puede distinguirse una mitocondria de él lisosoma, donde se contiene las enzimas digestivas que rompen las moléculas de las grasas, proteínas y ácidos nucleicos, dando constituyentes más pequeños que pueden ser oxidados por las enzimas de las mitocondrias.
El citoplasma contiene otras muchas inclusiones, especialmente interesantes son los centrosomas y los cinetosomas, los primeros son visibles al microscopio óptico cuando la célula se acerca a su momento de división actuando de polos del huso, al dividirse cromosomas. Los cinetosomas solo se encuentran en aquellas células que para su movilidad están equipadas con cilios o flagelos, teniendo ambos gránulos la propiedad de autoreplicación. Al microscopio electrónico cada uno es un cilindro constituido por once fibras, dos en el centro y las otras nueve en la parte externa.
El microscopio electrónico ha confirmado también otra conjetura de los primitivos citólogos: la de que el citoplasma tiene una organización invisible, un citoesqueleto”, la mayoría de las células presentan complicados sistemas de membranas internas, que no son visibles con el microscopio óptico ordinario, algunas de ellas son lisas y otras rugosas, con delicados granulitos ligados a una de sus superficies, variando el grado de desarrollo de estos sistemas de membranas, de célula a célula. Es el retículo endoplásmico. A través de la red de pequeños canales formados por la membrana, se supone que las sustancias se mueven desde la membrana más externa de la célula hasta la membrana del núcleo. Algunos investigadores sostienen que la membrana interna es continua con la membrana externa, proporcionando así una zona de superficie muy aumentada y profundamente invaginada para ponerse en comunicación con el fluido que baña la célula. Con estas funciones, es de suponer que la célula esté equipada con un lugar en donde se fabrique de forma continua la producción de membranas nuevas, misión esta que podría corresponder a los cuerpos de GOLGI.
De lo que no existe duda es de la naturaleza de los gránulos que aparecen de forma consistente en la superficie interna de la membrana. Estos gránulos son extremadamente ricos en RNA, y al mismo tiempo, activos en la síntesis de proteínas, es por ello que a estos gránulos se les denomina ahora ribosomas.
La membrana que rodea al núcleo de la célula forma la frontera interna del citoplasma. Al microscopio electrónico aparece como una doble membrana con agujeros que están en la parte externa abiertos hacia el citoplasma, y que para algunos significarían poros través de los cuales las grandes moléculas pueden moverse en ambas direcciones, también que la membrana nuclear pueda participar en la formación de la membrana del retículo, y por fin otra posibilidad sería que los fluidos que circulan a través de los pequeños canales del retículo endoplásmico salgan de por percolación y queden acumulados entre las dos tapas de la membrana nuclear.
Dentro del núcleo están los importantes filamentos de cromatina, en los que está localizado todo el complemento del DNA de la célula, que adquiere una máxima superficie de contacto con los otros materiales del núcleo, a partir del cual se forman las moléculas de RNA. Durante la preparación para la división la cromatina se retorcería fuertemente para formar los cromosomas.
Los nucléolos son corpúsculos esféricos que pueden verse fácilmente dentro del núcleo con el microscopio óptico. Al microscopio electrónico se observa que están formando un paquete de pequeños granulitos similares a los ribosomas del citoplasma. Son ricos en RNA y son centros activos de síntesis de proteínas y de RNA. Tanto la cromatina como los nucléolos se encuentran bañados por el jugo nuclear.
La imagen que hoy tenemos de la célula se debe pues a la notable historia del desarrollo de los instrumentos y de la técnica. El microscopio óptico sigue siendo un instrumento esencial, pero su uso para explorar el interior de la célula, exige la tinción y la muerte células. Los microscopios de contraste de fase, de luz polarizada y de fluorescencia, permiten manipular con la luz de diversas maneras para el estadio de la estructura celular sin que ello lleve consigo la muerte de la célula. En los últimos años, el microscopio electrónico se ha convertido en el instrumento primordial del citólogo, aunque tenga la limitación de requerir una preparación elaborada y la fijación de la muestra con lo cual pueden introducirse confusiones en la imagen de la célula debida a distorsiones y artefactos.
La bioquímica cuenta al igual que la citología con un notable desarrollo. Las modernas centrífugas han permitido separar fracciones cada vez más finas del contenido celular. Estas a su vez pueden subdividirse por métodos de cromatografía y electroforesis. Finalmente, la autoradiografía, utilizando isótopos radiactivos, permite al investigador observar a niveles subcelulares los procesos dinámicos de la célula viva.
CLAUDIO BERNARD (1878) señaló la importancia del medio interno “Milieu interieu” para reglar las actividades del tejido viviente, este concepto fue lentamente elaborado, la primera alusión a él aparece en 1852 pero no maduraría hasta los años 1854 – 1857. El determinismo, doctrina de la época, exige la existencia en el organismo de unas condiciones internas constantes merced a un medio uniforme que le regule.
Para AUGUSTO COMTE (1830) la idea de la vida es inseparable de la organización y del medio, y ROBIN (1849) exige como condición fundamental, la armonía entre el medio externo, al ser vivo y sus necesidades, ambos antecedentes parecen ser los más próximos a esta concepción del Medio Interno de BERNARD.
El organismo es para BERNARD una unidad, un todo integrado. Sus manifestaciones vitales son ciertamente de naturaleza físico-química, pero tienen lugar en elementos organizados, cuya organización y estructura son cuestión de la vida y de la evolución. La facultad requerida para la formación, le viene dada originalmente al ser vivo, esta “forcé vitale” es innegable y evidente como la luz del día dice BERNARD. En el organismo todo transcurre determinadamente, pues los mecanismos de la vida trabajan en un medio constante. Este es el concepto para la autonomía del organismo. Las manifestaciones de la vida son exteriorizaciones de esta organización.
Las células son autómatas capaces de vivir, desarrollarse y efectuar sus funciones especiales, mientras dispongan en el medio interno de concentraciones adecuadas de oxígeno, glucosa, diversos electrolitos, aminoácidos y sustancias grasas.
Mientras las condiciones normales persisten en el medio interno las células continuarán viviendo y funcionando adecuadamente. De esta forma cada célula se beneficia de la hemostasia y a la vez contribuye con la parte que le corresponde a mantener tal estado. Este juego mutuo proporciona un automatismo continuo de la economía hasta que en uno o más de los sistemas funcionales pierden su capacidad de contribuir con la parte correspondiente de función. Si esto ocurre sufren todas las células de la economía. La disfunción intensa de cualquiera de los sistemas integrados originan la muerte celular, la disfunción moderada causa enfermedad celular.
CONCLUSIONES:
1. Se cultivan fibroblastos procedentes de corazón de embrión de pollo, utilizando el método del coágulo y como medio de cultivo el Parker 199, realizándose la lectura en tiempos variables que oscilan entre uno y diez días. El método de tinción es el May-Grumwall-Giemsa.
2. Los cultivos fibroblásticos se han sometido al efecto de las radiaciones ionizantes, de distintos virus y diversas sustancias químicas.
3. Los efectos producidos por los virus, radiaciones y sustancias químicas se han valorado en función de la dosis y de si esta es única o repetitiva.
4. Las sustancias químicas analizadas (5-fluoracilo y silicona) producen un patrón de alteraciones que han consistido en inhibición o limitación del crecimiento, tumefacción y degeneración hidrópica, vacuolización, ruptura de la membrana celular, plasmodios y sincitios.
5. Estos efectos dependen de la especificidad citopatogénica de la sustancia a emplear, de la dosis y de si esta es única o de repetición, del efecto de inactivación que el medio tenga sobre la sustancia y de la edad del cultivo.
6. Los virus producen esfericidad celular, vacuolazación ó granulación citoplasmática, inclusiones citoplasmáticas, ruptura de membrana y fusión celular, formación de células gigantes multinucleadas.
7. Los efectos citológicos producidos por los virus varían en función de la sensibilidad de los tejidos al tipo de virus, a la cepa del mismo virus, al paso continuo del virus al tejido, a la adición intermitente del virus al tejido y a los cambios de estado nutritivo del mismo.
8. Las radiaciones ionizantes actúan a nivel del núcleo celular produciendo tumefacción, picnosis y vascuolización. A dosis crecientes aumenta el tamaño del núcleo y la proporción de células multinucleadas, progresivamente desde 1.000 rds. hasta 21.000 rds. A partir de esta dosis de irradiación, y para dosis mayores el tamaño del núcleo tiende a descender. El tamaño máximo corresponde entre 9.000 rds. y 24.000 rds.
El grupo de células multinucleadas presenta su máxima frecuencia en los grupos irradiados entre 17.000 rds. y 24.000 rds.
9. Las radiaciones ionizantes actúan sobre el citoplasma produciendo vacuolización, como fenómeno fundamental en la membrana celular alteraciones funcionales del equilibrio electrolítico, así como de la regulación enzimática y de la respiración celular, morfológicamente el efecto se caracteriza por la aparición de vacuolas y rotura de la membrana celular.
10. Los efectos de las radiaciones ionizantes dependen por tanto de la dosis administrada, de si esta es única o de repetición, del estadio biológico celular y de la edad del cultivo.
