Resumen de Genetic and insecticidal characterization of "Bacillus thuringiensis" strains
- español
En los últimos años, ha habido un creciente interés por la búsqueda de agentes de control de plagas alternativos a los que tradicionalmente se han venido utilizando. Una buena parte de este interés se ha centrado en la bacteria entomopatógena "Bacillus thuringiensis" lo que ha conducido al establecimiento de numerosas colecciones que están siendo evaluadas y caracterizadas para determinar su utilidad en protección de cultivos. Dentro de esta tendencia, en el Laboratorio de Entomología Agrícola y Patología de Insectos (LEAPI) de la Universidad Pública de Navarra, se ha establecido una colección de más de 1400 aislados de "B. thuringiensis", que representan una enorme variedad de perfiles proteicos distintos. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido la caracterización genética e insecticida de una buena parte de las cepas de esta colección, para determinar su potencial como bioinsecticidas o como fuentes de genes de interés en la construcción de organismos transgénicos. La identificación serológica del antígeno flagelar (antígeno H) reveló la presencia de cuatro serovares nuevos que no habían sido descritos previamente. Dos de ellos, "B. thuringiensis", serovar ibérica (serotipo H59) han sido completamente caracterizados y constituyen el contenido del segundo capítulo de esta tesis. También se han caracterizado desde un punto de vista genético e insecticida otras cepas, que en bioensayos preliminares, mostraron una buena actividad tóxica para una o más de las especies fitófagas que originan plagas importantes en España. La cepa LEAPI01, fue aislada de una larva muerta del lepidóptero "Mythimna loreyi", y resultó ser muy tóxica contra varios "lepidópteros (Spodoptera exigua, S. littoralis, S. frugiperda y Helicoverpa armigera)". Esta cepa presentaba grandes cristales bipiramidales y un contenido génico consistente, según la identificación realizada por PCR, en seis genes "cry" que codifican para proteínas tóxicas contra lepidópteros: cry1Aa, cry1Ab, cry 1Ca, cry1Da, cry2Ab y cry1Ia. Las proteínas Cry2 y Cry1I no se detectaron mediante SDS-PAGE, lo que sugiere una falta de expresión o una baja expresión de los respectivos genes.
En una selección de cepas con actividad insecticida contra "S. exigua", se ha demostrado que existe una correlación entre el contenido génico y la actividad insecticida para varias especies del género "Spodoptera". Sin embargo, algunas de estas cepas resultaron ser no tóxicas contra "S. littoralis", S. frugiperda", o ambas especies, a pesar de que contienen genes que codifican para proteínas para las que se conoce su actividad tóxica contra estas especies. La presencia de genes "cry" que codifican para proteínas activas contra especies del género "Spodoptera" es más frecuente en cepas del serovar aizawai que en cepas de otros serovares. El análisis plasmídico de varias cepas que contienen un gen cry1A (cry1Aa, cry1Ab o cray1Ac) mostró que los perfiles plasmídicos son más similares en cepas de un mismo serovar que entre cepas de distintos serovares. Dado que la mayoría de los genes "cry" se localiza en plásmidos, este resultado sugiere un intercambio plasmídico más fluido entre cepas de un mismo serovar.
- English
During the last years, there has been a growing interest in alternative agents for pest control. The research carried out worldwide on the enthomopatogeneous bacteria "Bacillus thuringiensis" has led to a number of sreening programs resulting in broad collections which are characterized in order to determine their potential in crop protection. In this scenario, the Laboratorio de Entomología agrícola y Patología de Insectos (LEAPI) of the Public University of Navarra has set a collection of more tan 1400 "B. thuringiensis" isolates, representing a high variety of distinct protein profiles. The objetive of the present Ph. D. Thesis has been the genetic and insecticidal characterization of many of these strains, in order to determine the potential for their use either as bioinsecticides or as a source of interesting genes for the construction of genetically enginered organisms. The serological identification of the flagelar (H) antigen performed revealed the presence in the LEAPI collection of four novel "B. thuringiensis" serovars previously undescribed. The characterization of two of them: "B. thuringensis" serovars pirenaica and ibérica (serotypes H57 and H59, respectively) constitutes the second chapter of this thesis. Other strains were selected for characterization on the basis of their insecticidal activity against one or more of the insect species thar are important pests in Spain. The strain LEAPI01, which was isolated from a dead larvae of the lepidopteran "Mythimna loreyi" was found to be highly toxic towards several lepidopteran pests ("Spodoptera exigua, S. littoralis, S. frugiperda and Helicoverpa armígera"). This strain exhibited large bipiramidal crystals, and a set of six different "cry" genes, as determined by PCR, which encode proteins toxic on lepidopterans (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ca, cry1Da, cry2Ab and cry1Ia). The Cry2 and Cry1I proteins could not be identified in the SDS-PAGE performed, suggesting a lack of expression or a low expression of the corresponding genes.
In strains selected on the basis of their activity against "S. exigua", correlation between gene contents and insecticidal activity on serveral of the genus "Spodoptera" was also found. However, some strains were found to lack activity against S. littoralis", "S. frugiperda" or both species, in spite of presenting genes which code for proteins active on these species. Interestingly, some "cry" genes were found to be more frequent within serovar aizawai tan in other serovars. The plasmid analysis of several strains harbouring one cry1A gene (cry1Aa, cry1Ab or cry1Ac) showed that the plasmid patterns were similar in strains of the same serovar, confirming that the genetic diversity of "Bacillus thuringiensis" is wider among than inside serovars. Sincé most of the "cry" genes are located on plasmids, this result suggets a specially fluent plasmid exchange among strains belonging to the same serovar.
