Real-time visualization of phosphatidic acid in live cells using novel sensors based on fret
- Autores: José Pedro Ferraz Nogueira
- Directores de la Tesis: Juan Llopis Borrás (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Díez Guerra (presid.), José Ángel Martínez Menárguez (secret.), Nicolas Vitale (voc.)
- Materias:
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- Resumen
- español
Español:
Este proyecto de tesis se ha centrado en el desarrollo de indicadores fluorescentes capaces de detectar cambios en los niveles de ácido fosfatídico (PA) en células vivas. El PA es el diacilglicerofosfolípido de estructura más sencilla y existe en las membranas celulares de todos los organismos vivos. Está en el centro de las rutas metabólicas de lípidos estructurales, de señalización y de almacenamiento de energía. Además, es un lípido estructural y un segundo mensajero. Su pequeño tamaño en forma de cono proporciona flexibilidad y una curvatura negativa a las bicapas lipídicas, y sus funciones de señalización vienen determinadas por su grupo fosfomonoéster, que distingue el PA de otros mediadores lipídicos y que proporciona un ambiente especial para el anclaje de las proteínas de unión a PA. Este fosfolípido ha atraído considerable atención debido a su papel como mediador lipídico y al gran número de efectores, que incluyen proteínas implicadas en la reorganización del citoesqueleto, el tráfico de vesículas, el crecimiento celular, la migración, la proliferación y la supervivencia celular.
Tradicionalmente, los niveles de PA se han medido con cromatografía de capa fina y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Los recientes avances en esta última técnica han permitido la caracterización detallada del contenido y la composición de las cadenas acilo de PA en células y tejidos, pero a costa de perder su distribución espacial intracelular. Para revelar la producción de PA en los niveles celular y subcelular, se han descrito indicadores fluorescentes basados en dominios de unión a PA etiquetados con GFP. Estas quimeras se translocan a la membrana plasmática ante la producción de PA y proporcionan suficiente especificidad. Sin embargo, dichas sondas a menudo sólo proporcionan una información cualitativa y no permiten obtener imágenes de cambios de PA en subdominios particulares de las membranas u orgánulos.
Para superar estas limitaciones, hemos construido biosensores genéticamente codificados, basados en transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). Hemos desarrollado construcciones utilizando los dominios de unión a PA de dos proteínas de unión a PA, neurogranina y Spo20, en combinación con las proteínas fluorescentes ECFP y variantes de Venus. En las quimeras sensibles a PA, hemos encontrado una relación inversa entre los niveles de PA y la eficiencia de FRET del sensor. La quimera con el mayor cambio de FRET se modificó para su expresión en la membrana plasmática y membrana mitocondrial externa, y así ser capaces de detectar fluctuaciones de los niveles de PA en células de mamífero in vivo.
Los estudios llevados a cabo con el sensor dirigido a la membrana plasmática han mostrado variabilidad en los niveles basales de PA y en la actividad de la fosfolipasa D entre diferentes tipos celulares. Además, estímulos que activan las fosfatasas de PA, reduciendo los niveles de éste, estimularon la formación de lamelipodios y filopodios. Se observaron niveles más bajos de PA en el borde anterior que en el borde posterior de células HeLa en migración. En líneas celulares derivadas de células de Schwann y oligodendrocitos, los procesos de membrana implicados en la mielinización presentaron niveles de PA más bajos que en el cuerpo de la célula. El sensor dirigido a la membrana mitocondrial externa ha permitido la medición de fluctuaciones de PA por primera vez en esta membrana. Estos resultados sugieren que las actividades de fosfolipasa D y diacilglicerol quinasa contribuyen a los niveles de PA de esta membrana. Por último, la privación de suero disminuyó los niveles de PA en células HeLa, tanto en la membrana mitocondrial externa como en la membrana plasmática.
En resumen, las sondas basadas en FRET para la detección de PA descritas han permitido obtener imágenes de la dinámica espacio-temporal del PA en la membrana plasmática y en la membrana mitocondrial externa. Las sondas han respondido a aumentos y disminuciones de PA y presentan un amplio rango dinámico. Además, hemos hallado fluctuaciones de PA durante la migración celular, la mitosis, los procesos de extensión de membrana, o durante la privación de suero. Estos nuevos biosensores, y versiones modificadas dirigidas a otras membranas, serán herramientas valiosas para ampliar nuestro conocimiento del papel del PA en la señalización intracelular y para estudiar la heterogeneidad subcelular de la formación de PA in situ.
- English
Inglés: This thesis project focused on the development of fluorescent indicators able to report changes in the levels of phosphatidic acid (PA) in live cells. PA is the simplest naturally occurring diacylglycerophospholipid and exists in cell membranes of all living organisms. It is at the center of the metabolic routes of structural, signaling and energy storage lipids. In addition, PA itself is a structural and signaling lipid. Its small cone shape provides flexibility and negative curvature to lipid bilayers, and its signaling functions are granted by its remarkable phosphomonoester headgroup, which distinguishes PA from other lipid mediators and provides a special environment for docking of PA binding proteins. PA has attracted considerable attention because of its role as a lipid mediator, and for the large number of effectors, which include proteins involved in cytoskeleton rearrangement, vesicle trafficking, cell growth, spreading, proliferation, and survival. Traditionally, PA levels have been measured with thin-layer chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Recent advances in the latter technique have allowed detailed characterization of the content and the acyl chain composition of PA in cells and tissues, but at the cost of losing its intracellular spatial distribution. To reveal PA production at the cellular and subcellular levels, fluorescent indicators featuring PA binding domains tagged to GFP have been reported. These chimeras translocate to the plasma membrane upon PA production and provide sufficient specificity. However, such probes often only provide qualitative information. In addition, they do not allow imaging PA changes in particular membrane subdomains or organelles. To overcome these limitations, we have constructed genetically-encoded Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors for PA detection. We developed constructs using the PA binding domains of two PA binding proteins, neurogranin and Spo20, and the fluorescent proteins ECFP and several variants of Venus. In the chimeras that were responsive to PA, we found an inverse relation between PA levels and the FRET efficiency of the sensor. The construct with the larger change was further optimized to target it to the plasma membrane and the outer mitochondrial membrane to report PA fluctuations therein, in live mammalian cells. The studies carried out with the plasma membrane targeted sensor indicated that both basal PA levels and phospholipase D activity varied in different cell types. In addition, we found that stimuli that activate PA phosphatases, leading to lower PA levels, increased lamellipodia and filopodia formation. Lower PA levels were observed at the leading edge than at the trailing edge of migrating HeLa cells. In cell lines derived from Schwann cells and oligodendrocytes, the membrane processes involved in myelination showed lower PA levels than the cell body. The sensor targeted to the outer mitochondrial membrane allowed the measurement of PA fluctuations for the first time in this membrane. It revealed that phospholipase D and diacylglycerol kinase activities contribute to mitochondrial PA pools. Finally, serum starvation decreased PA levels in HeLa cells, both in the outer mitochondrial membrane and the plasma membrane. In summary, the FRET probes for PA reported here allow imaging the spatio-temporal dynamics of the PA pools in the plasma membrane and the outer mitochondrial membrane. The probes responded to both increases and decreases of PA, and displayed a wide dynamic range. We also reported PA fluctuations during cell migration, mitosis, membrane process extension or upon serum deprivation. These new biosensors, and modified versions targeted to other membranes, will be valuable tools to expand our knowledge of the role of PA in intracellular signaling and to study the subcellular heterogeneity of PA formation in situ.
- español
