Regulation of Escherichia coli glycocen metabolism by GlgS and SpoT
- Autores: Mehdi Rahimpour
- Directores de la Tesis: Javier Pozueta Romero (dir. tes.), Francisco José Muñoz (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2013
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carlos Balsalobre Parra (presid.), Cristina Solano Goñi (secret.), Junkal Garmendia (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
El glucógeno es un homopolisacárido ramificado formado por moléculas de glucosa unidas por enlaces ¿-1,4 con enlaces ¿-1,6 en los puntos de ramificación. Este polisacárido de reserva se acumula en condiciones de crecimiento limitado cuando existe una fuente de carbono en exceso y deficiencia de algún otro nutriente. El papel de este poliglucano en bacterias no está tan definido como en animales o en levaduras, pero algunos estudios lo han relacionado con una mayor supervivencia en el medio ambiente, así como con la capacidad simbiótica, colonizadora y la virulencia de las bacterias.
En Escherichia coli la regulación de la biosíntesis de glucógeno comprende un complejo ensamblaje de factores que se ajustan al estado nutricional de la célula. A nivel de actividad enzimática el metabolismo del glucógeno está sujeto a los efectos negativos y positivos que ejercen el AMP y la fructosa 1,6-bisfosfato, respectivamente, sobre la ADP-glucosa (ADPG) pirofosforilasa (ClgC), la cual convierte el ATP y la glucosa-1-fosfato (G10) en ADPG para la síntesis de glucógeno. A nivel transcripcional el metabolismo del glucógeno está determinado por la regulación del operon glgBXCAP, que forma parte de los regulones RelA (enzima productora de tetra(penta)fosfato de guanosina ((p)ppGpp) y PhoP-PhoQ, permitiendo así que el metabolismo del glucógeno se ajuste al estado nutricional de la célula.
La acumulación del glucógeno está afectada posivamente por glgS, un gen que codifica una proteína hidrofílica de 7,9 kDa de función desconocida que no tiene homología con ninguna proteína fuera de la familia Enterobacteriaceae. Con el fin de conocer la función de GlgS y sus mecanismos de actuación, en el primer capítulo de este trabajo llevé a cabo un análisis transcriptómico de las células deleccionadas en glgS (¿glgS), las cuales presentan bajo contenido en glucógeno. La comparación con la cepa silvestre isogénica B225113 (WT) reveló que la expresión de glgS afecta negativamente a la expresión de genes implicados en la formación de orgánulos de superficie bacterianos tales como las fimbrias tipo 1 y flagelos, así como a la expresión de genes implicados en la síntesis de purinas y pirimidinas implicadas en la producción de polisacáridos de biofilm. Consistentemente, las células ¿glgS son hipermótiles, hiperfimbriadas y poseen un elevado contenido de exopolisacáridos (ácido colánico) y alta capacidad para producir biofilm. El análisis transcriptómico no mostró diferencias en los niveles de transcrito de glgBXCAP entre las células ¿glgS y WT, indicando que el efecto positivo que GlgS ejerce sobre la acumulación de glucógeno no se debe a cambios en los niveles de expresión de glgBXCAP en E. coli. Además, llevé a cabo un estudio de interacción génica entre glgS y los 3984 genes no esenciales de E. coli utilizando conjugación mediada por el plásmido F. Estos estudios mostraron que las mutaciones que afectan a la biosíntesis de AMP revierten el fenotipo de bajo glucógeno, elevada lproducción de biofilm e hipermotilidad de las células ¿glgS. El conjunto de los resultados obtenidos indicaron que el fenotipo de baja producción de glucógeno de las células ¿glgS puede ser atribuido a i) la elevada motilidad flagelar y la elevada actividad de biosíntesis de exopolisacálidos que compiten con GlgC por los mismos pools de ATP y G1P respectivamente y/o ii) el efecto inhibitorio que los elevados niveles de AMP ejercen sobre GlgC, de modo que el ATP y G1P ¿excedente¿ tras la inactivación de GlgC es dirigido hacia la propulsión flagelar y hacia la producción de polisacáridos de biofilm respectivamente. Consistentemente, encontramos que las células ¿glgS (que no acumulan glucógeno) muestran un fenotipo de alto contenido de biofilm y de ácido colánico. Además, la sobreexpresión de glgC revirtió el fenotipo glucógeno-deficiente, alto ácido colánico, elevado biofilm e hipermotilidad de las células ¿glgS. De acuerdo con etas observaciones propongo que GlgS funciona como un regulador negativo de procesos implicados en la propulsión (consumidora de ATP) y en la síntesis de polisacáridos de biofilm (dependiente de G1P) en células que entran en la fase estacionaria. Además propongo que la acumulación de glucógeno que ocurre durante la fase estacionaria se debe al consumo del excedente de ATP y G1P surgido como consecuencia de la inactivación de la propulsión flagelar y la producción de exopolisacáridos. Teniendo en cuenta que (a) GlgS se trata de un elemento determinante de la composición de la superficie celular y (b) su efecto sobre el metabolismo del glucógeno es indirecto, propongo que se cambie el nombre de GlgS por ScoR (de ¿Surface COmposition Regulator¿).
Tal y como he mencionado anteriormente, el metabolismo del glucógeno en E. coli es controlado por (p)ppGpp a nivel de la expresión del operon glgBXCAP. La acumulación de (p) ppGpp constituye el evento fundamental y desencadenante de la respuesta estricta, una respuesta pleiotrópica que se dispara en E. coli y en lamayoría de especies bacterianas ante situaciones de stress nutricional u otro tipo de stress causado por las condiciones del medio que conduce a la parada del crecimiento. Esta respuesta provoca una reestructuración global de los patrones de expresión génica que permite adaptar rápidamente e metabolismo celular a las nuevas condiciones limitantes, proteger las estructuras celulares y promover la supervivencia a largo plazo. Históricamente la primera (p)ppGpp sintasa descubierta fue la RelA de especies de enterobacterias tales como E. coli o Salmonella entérica. La segunda fuente fundamental de (p)ppGpp es el producto del gen SpoT .A pesar de la elevada homología con RelA, SpoT es una enzima bifuncional que posee tanto actividad (p)ppGpp hidrolasa como actividad (p)ppGpp sintetásica capaz de producir (p)ppGpp bajo una gran variedad de estreses nutricionales. Las cepas de E. Coli que llevan alelos de spoT con mutaciones que permiten una actividad SpoT reducida presentan un crecimiento bajo o nulo en medio mínimo, lo que normalmente se atribuye a la sobre-acumulación en estas bacterias de niveles tóxicos de (p)ppGpp producidos por la actividad no-controlada de RelA. Esta situación ha impedido llevar a cabo un análisis completo de la regulación del metabolismo del glucógeno por (p)ppGpp debido a la imposibilidad de producir mutantes por delección de spoT (¿spoT) en un fondo genético de relA+.
Para poder analizar con detalle la regulación del metabolismo de glucógeno por (p)ppGpp en E. coli, en el segundo capítulo de este trabajo intenté manipular los niveles celulares de (p)ppGpp construyendo mutantes ¿spoT mediante diferentes estrategias. Descubrimos que una mutación ¿spoT::Spc podía ser transferida por transducción desde células ¿relA¿spoT previamente construidas a células relA+. Diversos mutantes ¿spoT así obtenidos fueron caracterizados tanto a nivel bioquímico como a nivel de secuenciación de varios genes implicados en el mecanismo de acción de (p)ppGpp. Los mutantes ¿spoT analizados pudieron dividirse en dos categorías principales: (i) clones ¿spoT con niveles no detectables de ppGpp y bajo contenido de glucógeno como consecuencia de la baja expresión del operón glgBXCAP y (ii) clones ¿spoT que acumulaban ppGpp a niveles parecidos a los observados en la glgBXCAP. Mediante el análisis del genoma completo obtenido por secuenciación a gran escala de cinco clones ¿spoT fue posible identificar aquellos las mutaciones compensatorias del efecto negativo causado por la mutación ¿spoT. Tanto estos estudios como estudios de secuenciacióndel gen relA en todos los clones ¿spoT, revelaron que en todos los casos diversos alelos mutantes de relA fueron seleccionados para compensar el efecto de la ausencia total de la función SpoT. Algunos clones ¿spoT tuvieron mutaciones compensatorias adicionales den genes diferentes a relA, como son glnB y yejB, sugiriendo la existencia de una fuerte presión evolutiva (producida por la ausencia de spoT) para el incremento del ¿fitness¿ bacteriano. Inesperadamente, las secuencias de genes implicados en el mecanismo de acción de ppGpp, tales como rpoS, dksA, rsd, ssrS y rpoB en todos los mutantes ¿spoT caracterizados en este trabajo fueron idénticas a las de los mismos en la cepa silvestre. Es reseñable que, independientemente de la presencia de niveles detectables de ppGpp e independientemente de tipo de RelA expresado en los mutantes analizados, todos los clones ¿spoT mostraron fenotipos de crecimiento lento comparados con la cepa silvestre, indicando una posible participación de SpoT en procesos importantes para el crecimiento bacteriano no relacionados con el metabolismo de (p)ppGpp.
