Nuevas estrategias y mecanismos de inmunomodulación en el tratamiento de las hemopatías malignas
- Autores: Isabel Álvarez Laderas
- Directores de la Tesis: JA Pérez-Simón (dir. tes.), Teresa Caballero Velázquez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Número de páginas: 139
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María Moraleda Jiménez (presid.), Idelfonso Espigado Tocino (secret.), Araceli Beatriz Martín Antonio (voc.), Antonio Núñez Roldán (voc.), Fermín Sánchez-Guijo Martín (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
1. INTRODUCCIÓN El sistema inmune desempeña un doble papel contra el cáncer: impide el desarrollo de células tumorales y modela la inmunogenicidad de las células tumorales. Este sistema es un ejemplo de autorregulación sutil en el que podemos intervenir con diversas drogas. Los IMiDs son una familia de compuestos inmunomoduladores empleados en el tratamiento de diversas enfermedades debido a sus propiedades inmunomuduladoras y anti-tumorales. Por otro lado, los polifenoles son un grupo de sustancias químicas que se encuentran en las plantas y presentan diversas propiedades biológicas, fundamentalmente antioxidativas y antiproliferativas Ambos grupos de compuestos actúan a a través de diversos mecanismos, algunos de ellos escasamente conocidos, lo que, unido al hecho de que aún en la actualidad se están identificando gran cantidad de polifenoles, convierte a estos compuestos en un área de investigación con un potencial realmente interesante, tanto desde el punto de vista básico como por su potencial uso en clínica.
En este trabajo nos centraremos en el estudio de la pomalidomida y polifenoles derivados del aceite de oliva como agentes inmunomoduladores.
IMIDS. Mecanismos de acción Los IMiDs son análogos de la talidomida, derivado del ácido glutámico con propiedades anti- angiogénicas y anti- inflamatorias. Pueden ejercer un efecto anti-tumoral debido a su actividad antiproliferativa, además poseen propiedades anti-inflamatorias y pueden ejercer un efecto inmunomodulador entre los nuevos ImiDs, estacan la lenalidomida y la pomalidomida en los que nos centraremos.
Las células T CD4 juegan un papel importante en la protección inmune. Esto se debe a su capacidad para estimular la citotoxicidad celular y humoral, estimular la actividad microbicida de los macrófagos , reclutar neutrófilos, eosinófilos y basófilos en sitios de infección e inflamación, entre otros mecanismos. Dependiendo de las señales producidas por las células inmunes innatas , las células T CD4 vírgenes pueden diferenciarse en distintas células efectoras: T helper1 (Th1), T helper 2 (Th2), Th17 o T reguladoras (Treg).Los eventos de señalización que conducen a la polarización de los subconjuntos de CD4 cada vez son más conocidos. La diferenciación de los linfocitos está regulada por diversos factores de trasncripción y citocinas. La interleucina-12 (IL-12), que actúa a través del transductor de señales y activador de la transcripción 4 (Stat4), inicia el desarrollo de células Th1 que producen interferón-γ (IFN-γ) y expresan el factor de transcripción T-bet. La respuesta celular de células Th2 se caracteriza por la expresión de IL-4 e IL-13. IL-4 activa a Stat6 e induce al factor de transcripción GATA 3 (Gata3). Por otro lado, el factor de transcripción Foxp3, esencial para el desarrollo de Treg, puede ser inducido por TGFβ-1 e IL-2.
La capacidad de la talidomida para co-estimular a los linfocitos T fue descrita por Haslett et al. y posteriormente confirmada con lenalidomida y pomalidomida. Se ha demostrado como la pomalidomida co-estimula linfocitos T a un nivel 100 o 1000 veces mayor que la talidomida elevando la expresión de TNF-α, IL2 e INF-γ en células mononucleadas de sangre periférica activadas con anti-CD3. A pesar de que la activación de las células T CD4 con pomalidomida se ha relacionado con moléculas de la señalización in vitro de CD28, el efecto de la pomalidomida en la diferenciación de células T naive no está claro.
Polifenoles El trasplante hematopoyético representa la única opción curativa para numerosos pacientes con hemopatías malignas. Se fundamenta en la sustitución de un sistema hematopoyético neoplásico, defectuoso o insuficiente, por otro normal obtenido de un donante sano histocompatible. Para ello los pacientes reciben previamente un régimen de acondicionamiento basado en la administración de quimioterapia, a menudo combinada con radioterapia o depleción de linfocitos T. De esta forma se reduce el número de células malignas y se inmunosuprime al receptor para disminuir el riesgo de rechazo del injerto. Tras el acondicionamiento se administran las células progenitoras capaces de reconstituir el sistema hematopoyético. Estas células enriquecidas en progenitores hemopoyéticos (PH), contienen células T , B, y células CD4+ CD8+. Tienen efectos beneficiosos antitumorales pero además pueden hacer un reconocimiento antigénico del receptor que se expresa clínicamente como enfermedad del injerto contra el húesped (EICH).
Los polifenoles son un grupo de sustancias químicas que se encuentran en las plantas, se caracterizan por la presencia de más de una unidad de fenol con uno o más grupos hidroxilo. Presentan diversas propiedades biológicas: antioxidativas, induccion de enzimas de desintoxicación, inhibición de enzimas de bioactivación, antiproliferativas, y detección del ciclo celular y la apoptosis. Esto los hace potentes agentes quimiopreventivos que interfieren con cada etapa de la carcinogénesis: iniciación, promoción y progresión.
Diversos estudios han demostrado que ciertos productos químicos derivados de plantas pueden disminuir la gravedad de los problemas asociados a trasplante, tales como la EICH y los rechazos del injerto. Kanamune et al. demostraron que el epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un tipo de polifenol del te verde, puede atenuar la severidad de la EICH en estadio temprano en el contexto del aloinjerto murino in vitro e in vivo.
2. HIPÓTESIS • La pomalidomida actúa sobre linfocitos T en estado de reposo, facilitando su polarización una vez activados no sólo hacia Th1, sino también hacia Th2 y Treg.
• Los polifenoles podrían ser capaces de inhibir el aloreconocimiento de linfocitos T y de atenuar la EICH en el receptor.
3. OBJETIVOS • Analizar el efecto de la pomalidomida en la polarización de linfocitos CD45RA a linfocitos Th1, Th2 y Treg.
• Estudiar los mecanismos de acción a través de los cuáles la pomalidamida ejerce su efecto inmunomodulador.
• Analizar el efecto de los polifenoles sobre la viabilidad y la activación de linfocitos en cultivo.
• Analizar las vías de señalización que se afectan bajo el tratamiento de polifenoles y que evitan la activación linfocitaria o que inducen la muerte de linfocitoss activados.
En el caso de que los objetivos anteriormente mencionados confirmaran nuestra hipótesis, nos plantearíamos analizar si el uso de una dieta rica en polifenoles en un modelo murino de EICH retrasa la aparición de EICH o disminuye su severidad.
4. METODOLOGÍA Obtención de muestras Las muestras fueron obtenidas a partir de Buffy Coats de donantes sanos. Todos los donantes firmaron el consentimiento informado que contempla la utilización de muestras biológicas con finalidad científica.
Aislamiento de células mononucleadas y células CD45RA Se aislaron las células mononucleadas a partir de Buffy Coat mediante centrifugación en gradiente de densidad con ficoll-hypaque (Amersham Biosciences), y se procedió al aislamiento de las células CD45RA mediante separación inmunomagnética con microbolas magnéticas conjugadas con anti-CD45RA (CD45RA MicroBead Kit Human de MACS, Miltenyi Biotec).
Cultivos celulares Las células CD45RA se cultivaron 5 días a 37ºC en estufa de CO2 en las distintas condiciones de polarización. Para la polarización a Th1 se utilizó: IL12, INF-γ y Anti-IL4, para Th2: IL4, IL2, Anti-INF-γ y Anti-IL12 Además, se ultilizaó pomalidomida a distintas concentraciones para evaluar su efecto sobre los tres tipos de polarizaciones.
Las células mononucleadas se cultivaron 18h y 48h a 37ºC en estufa de CO2 en condiciones de activación (anti-CD3, anti-CD28) a distintas dosis de polifenoles.
Análisis del inmunofenotipo mediante citometría de Flujo Las células fueron fenotipadas usando las siguientes combinaciones de anticuerpos monoclonales: isothiocyanate (FITC)/phycoerythrin (PE)/peridin chlorophyll proteincyanine-5 (PerCP-Cy5)/allo-phycocyanin (APC): CD25/INFγ/CD3/IL2 para detectar linfocitos Th1, CD25/IL10/CD3/IL4 para linfocitos Th2, Para evaluar la viabilidad y activación linfocitaria se usó la siguiente combinación de anticuerpos: CD45/CD25/7AAD/CD3.
La adquisición de datos se llevó a cabo en el citómetro FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) usando el programa CellQuest (BD Biosciences) y el análisis se realizará con el programa Infinicyt (Cytognos, Salamanca Spain).
Análisis epigenético Se realizó el análisis epigenético de la serie completa de linfocitos (naive, Th2, Th1) expuestos a distintas dosis de pomalidomida. Dado que la marca más robusta para mirar activación de histonas es la H3K4me3, se inmunoprecipitó con este anticuerpo para ver los cambios en las muestras.
Análisis de vias de señalización afectadas bajo el tratamiento de polifenoles Mediante Western blot se analizó la expresión de distintas proteinas implicadas en vias de señalización.
Modelo murino de EICR Para la generación de EICR murino empleamos como donantes ratones de entre 8 -10 semanas de la cepa C57BL/6 con haplotipo H2b y como receptores ratones de entre 8-10 semanas de la cepa BALB/c con haplotipo H2d. Se analizaron los efectos de una dieta estándar suplementada con 600 ppm de FP, sobre la aparición de EICR y la supervivencia de cada grupo experimental.
Evaluación de EICR.
Los ratones receptores después de ser irradiados se estabularon en jaulas estériles con aisladores de aire filtrado y presión positiva.
Todos los ratones de cada jaula recibieron el mismo tipo de dieta y a la cantidad de 3 gramos diarios por ratón. Se valoró individualmente tres veces a la semana la variación del peso así como la aparición de otros signos de EICR (postura, actividad, erizamiento del pelo e integridad de piel) empleando una escala de 0-2 5. CONCLUSIONES.
1. La pomalidomida favorece la polarización de células CD45RA+ hacia linfocitos Th1 y Th2 y este efecto depende del tipo de citoquinas utilizadas en el medio de cultivo. Es decir, la pomalidomida estimula la producción de IFN-γ e IL-2 en condiciones de polarización Th1 y la producción de IL-4 e IL-10 en presencia de condiciones de polarización hacia linfocito Th2.
2. La pomalidomida aumenta la expresión del factor de transcripción T-bet en células CD45RA+ expuestas a IL-12, INF-γ y anti-IL-4 y del factor de transcripción GATA-3 en células T naïve cultivadas con IL-4, IL-2, anti-IFN-γ y anti-IL-12.
3. El tratamiento de células T naïve con pomalidomida afecta los mecanismos epigenéticos durante la polarización de las células T; así, la pomalidomida en combinación con citocinas que favorecen la diferenciación Th1 y Th2, aumenta las marcas de activación H3K4me3 en los factores de transcripción T-bet y GATA3, respectivamente..
4. Los polifenoles presentes en el AOVE disminuyen la activación y la proliferación de los linfocitos T y la producción de citocinas como IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ y TNF-α en cultivo.
5. La FP del AOVE disminuye la expresión de p-AKT en linfocitos estimulados con anti-CD3/anti-CD28 y disminuye la fracción nuclear de NF-kB.
6. El uso de una dieta rica en FP del AOVE disminuye la aparición de EICRa en modelo murino tras trasplante alogénico aumentando la supervivencia que aquellos ratones alimentados con una dieta suplementada con FP.
7. A nivel histológico, la FP del AOVE reduce fundamentalmente la severidad de la EICRa intestinal, disminuyendo el número de cuerpos apoptóticos, por lo que ejerce un efecto local especialmente evidente en tubo digestivo.
