Analisis mediante rt-pcr de la enzima tirosinasa en sangre periferica de pacientes con melanoma. Prueba para la evaluacion de la progresion de la enfermedad
- Autores: Esmeralda Esperanza Carrillo Delgado
- Directores de la Tesis: Antonia Aránega Jiménez (dir. tes.), Salvio Serrano Ortega (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 1999
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Ocaña Sierra (presid.), Luis Álvarez Guisado (secret.), Francisco M. Camacho Martínez (voc.), Juan Antonio Marchal Corrales (voc.), Consolación Melguizo (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El interés de nuestra investigación se ha centrado en la detección en sangre periférica de la enzima tirosinasa mediante la Reacción de la Transcriptasa Inversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa en 58 pacientes diagnosticados con melanoma cutáneo.
Para ello hemos utilizado diferentes técnicas:
- Selección de los primeros para amplificar la enzima tirosinasa se llevó a cabo mediante el programa OIGO 1000 DNA.
- Las muestras procesadas fueron: ganglios linfáticos de pacientes con MC de estadio III, como controles positivos, muestras de sangre sin evidencia de enfermedad, como controles negativos y muestras de sangre de pacientes diagnosticados de melanoma en diferentes estadios.
- El procesamiento de extracción de ARN de muestras de sangre, se utilizaron dos procedimientos: el primero basado en la obtención de ARN a partir de monocitos y en el segundo a partir de linfocitos.
- Para cuantificar la cantidad de ARN se utilizó un espectrofotómetro de ultravioleta a una densidad óptica entre 260nm y 280nm. El chequeo del ARN se realizó mediante electrofóresis en un mini gel de agarosa al 1%.
- La síntesis de ADNc se realizó mediante transcriptasa reversa.
- La PCR se realizó con primers para la * * * actina que fue usada como control y primers específico para el gen de la tirosinasa. La visualización se realizó mediante electrofóresis.
- Por último realizamos el análisis estadístico mediante el programa informático de epidemiología SPSS (versión 8.0).
Los resultados obtenidos han sido los siguientes:
- Los primers M1 y M2 correspondientes a los exones 1 y 3 del gen de la tirosinasa son los más específicos para la detección de células de melanoma en sangre periférica con una Tm de 55grados C.
- La extracción de ARN a partir de un pellet de linfocitos de muestras de sangre se presenta como el mejor procedimiento para la amplificación mediante PCR del ADNc de la tirosinas
