Resumen de Efecto in vivo de QNRA1, QNRB1 y QNRS1 en la actividad de Fluoroquinolonas frente a cepas de Escherichia coli con o sin mutación en Gyra
FUNDAMENTOS.
Los genes qnr inducen niveles de sensibilidad reducida a quinolonas, no alcanzándose por su presencia aislada los niveles de resistencia en base a los puntos de corte establecidos por el Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) o por el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). No obstante, estudios in vitro muestran que la presencia de los genes qnr aumentan la concentración de quinolonas necesaria para prevenir la aparición de cepas mutantes a las mismas.
Por otro lado, los estudios realizados hasta el momento sobre la implicación in vivo de la presencia de los genes qnr frente al tratamiento con quinolonas se centran en ciprofloxacino, y en el modelo murino de infección del tracto urinario, no reflejándose la implicación de estos genes en la eficacia del tratamiento con quinolonas en otras patologías graves, como las neumonías. Aunque la tasa de neumonías producidas por E. coli es baja, esta bacteria causa el 4,3% de los casos graves de neumonía adquirida en la comunidad, con una mortalidad asociada del 35%; igualmente, E. coli es uno de los agentes causantes de la neumonía nosocomial tardía.
En resumen, la escasa información disponible sobre la implicación in vivo del efecto de los genes qnr, así como que la mayoría de los trabajos están centrados en el efecto sobre el tratamiento con ciprofloxacino, justificaron el desarrollo de este proyecto de investigación.
¿ HIPÓTESIS.
Las hipótesis del estudio son dos:
1. La presencia de genes qnr disminuye la eficacia in vivo de las fluoroquinolonas en infecciones producidas por microorganismos que expresan estos genes, a pesar de continuar siendo sensibles a aquellas.
2. La acción conjunta en una misma cepa de la mutación primaria en gyrA y de alguno de los genes qnr induce el fallo terapéutico del tratamiento con fluoroquinolonas, a pesar de continuar siendo sensibles a las mismas.
¿ OBJETIVOS.
El objetivo general de esta Tesis ha sido la evaluación in vivo, en un modelo experimental murino de neumonía causada por E. coli, del efecto de la presencia de genes qnr sobre la eficacia terapéutica de diferentes fluoroquinolonas, utilizando cepas sensibles a las mismas.
Los objetivos específicos del estudio son los siguientes:
1. Valorar la eficacia in vivo de diferentes fluoroquinolonas en un modelo experimental de neumonía en ratones inmunocompetentes, producida por cepas de Escherichia coli que expresan qnrA1, qnrB1 o qnrS1.
2. Estudiar el comportamiento terapéutico in vivo, en el modelo experimental, de las fluoroquinolonas frente a cepas de Escherichia coli que expresan de forma conjunta la mutación primaria en gyrA y los genes qnrA1, qnrB1 o qnrS1.
¿ METODOLOGÍA.
Cepas bacterianas del estudio.
En el marco del proyecto ¿Efecto de QnrA, QnrB y QnrS sobre la actividad in vitro e in vivo de fluoroquinolonas frente a Enterobacteriaceae¿ (PI060580), financiado por el Fondo para la Investigación Sanitaria del Instituto de Salud Carlos III, el grupo dirigido por el Dr. Álvaro Pascual en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla, se construyeron las cepas que se han utilizado en este estudio y que se detallan a continuación, las cuales fueron cedidas amablemente para los trabajos de la presente Tesis Doctoral.
Para ello, a partir de la cepa clínica K. pneumoniae N5, portadora de qnrA1, y de dos cepas de E. coli¿ portadoras de qnrS1 y qnrB1, fueron clonados los diferentes genes qnr para la construcción de las cepas del estudio que se resumen en la tabla 1.
Posteriormente, se caracterizó el perfil de sensibilidad a ciprofloxacino y levofloxacino de las diferentes cepas, mediante la determinación de la CMI y la CMB, usando la metodología estándar del CLSI. Los resultados se expresan en la tabla 2.¿ Tabla 1. Cepas bacterianas del estudio.
Cepas GyrA Gen qnr Grupo isogénico de E. coli ATCC 25922/pBK E. coli ATCC/pBK Salvaje pBK-CMV E. coli ATCC/qnrA Salvaje pBK-qnrA1 E. coli ATCC/qnrB Salvaje pBK-qnrB1 E. coli ATCC/qnrS Salvaje pBK-qnrS1 Grupo isogénico de E. coli ATCC 25922 -S83L/pBK E. coli ATCC-S83L/pBK Ser83Leu pBK-CMV E. coli ATCC-S83L/qnrA Ser83Leu pBK-qnrA1 E. coli ATCC-S83L/qnrB Ser83Leu pBK-qnrB1 E. coli ATCC-S83L/qnrS Ser83Leu pBK-qnrS1 Tabla 2. CMI y CMB de ciprofloxacino y levofloxacino de las cepas del estudio.
Cepa CMI/CMB (mg/L) Ciprofloxacino Levofloxacino Grupo isogénico de E. coli ATCC 25922/pBK E. coli ATCC/pBK 0,002/0,015 0,008/0,03 E. coli ATCC/qnrA 0,125/0,125 0,5/0,5 E. coli ATCC/qnrB 0,125/0,125 0,125/0,25 E. coli ATCC/qnrS 0,125/0,25 0,5/0,5 Grupo isogénico de E. coli ATCC 25922-S83L/pBK E. coli ATCC-S83L/pBK 0,125/0,125 0,125/0,25 E. coli ATCC-S83L/qnrA 0,5/0,5 0,5/0,5 E. coli ATCC-S83L/qnrB 0,5/0,5 0,25/0,5 E. coli ATCC-S83L/qnrS 1/1 ¿ Tomando como puntos de corte los establecidos por el CLSI (2) todas las cepas utilizadas en el estudio fueron sensibles tanto a ciprofloxacino como a levofloxacino.
Modelo de neumonía murina por Escherichia coli.
Para la producción de la neumonía experimental en los ratones C57BL/6 se llevó a cabo una modificación del modelo descrito por Esposito y Pennington.
Los inóculos se prepararon con una solución de mucina gástrica porcina diluida al 5% p/v como adyuvante.
La concentración bacteriana final del inóculo empleado fue de 8,9 ± 0,19 Log10 UFC/mL.
Cada animal fue inoculado intratraquealmente con 50 µL del inóculo bacteriano.
Se diferenció entre mortalidad relacionada con la técnica quirúrgica/anestesia (mortalidad precoz) y mortalidad relacionada con la neumonía. Se definió muerte relacionada con la técnica quirúrgica/anestesia a la que acaeció en la primera hora desde la inoculación, o durante la misma.
El sacrificio de los animales supervivientes tras finalizar los experimentos se realizó mediante la administración de una inyección letal de 0,2 mL de tiopental sódico al 5% p/v ip. Tanto los animales supervivientes sacrificados como aquellos animales que fallecieron durante el experimento fueron procesados de igual forma para la obtención de las muestras, en ambos casos en el momento más próximo tras el fallecimiento. Para la obtención de las muestras, con técnica aséptica se procedió a la apertura torácica a la altura del esternón con tijeras y pinzas estériles. Posteriormente, mediante una jeringa con aguja subcutánea, se realizó una punción intracardíaca para exanguinar al animal y realizar después hemocultivos cualitativos con los que conocer la presencia de bacteriemia en los animales. A continuación, se extrajeron los pulmones y el corazón en bloque, procediéndose sobre una placa de Petri estéril a la separación cuidadosa de los pulmones.
El tejido pulmonar se procesó para conocer el número de UFC/g de tejido. La sangre extraída por punción intracardíaca se procesó para hemocultivos cualitativos. Los resultados se expresaron como positivo o negativo.
Estudios farmacocinéticos.
Para la elección de las dosis de quinolonas a administrar nos basamos, primero, en la farmacocinética en humanos y, en segundo lugar, en el ajuste del parámetro farmacodinámico predictor de eficacia para las fluoroquinolonas, el cual fue el AUC0-24h/CMI superior a 100.
Una vez elegidas las dosificaciones que iban a ser utilizadas in vivo, evaluamos los parámetros farmacocinéticos de los antimicrobianos administrados en monoterapia a las dosis decididas para el tratamiento. Así, se evaluaron en un grupo al que se le administró ciprofloxacino 20 mg/Kg y en dos grupos en los que se administró levofloxacino 25 mg/Kg y 75 mg/Kg, respectivamente.
La determinación de las concentraciones séricas de ciprofloxacino y levofloxacino se realizó mediante bioensayo con el método de difusión en placa. La técnica de bioensayo mediante difusión en placa consiste en determinar la concentración de un antimicrobiano, estimándola a partir de una recta de regresión, construida mediante la medición de los halos de inhibición del crecimiento de un microorganismo control utilizando concentraciones conocidas del mismo antibiótico. Para ello utilizamos como cepa indicadora E. coli ATCC 25922 y como medio de cultivo MHA.
Con las concentraciones séricas obtenidas de ciprofloxacino y levofloxacino se procedió al cálculo de los parámetros farmacocinéticos, siguiendo un modelo monocompartimental.
Los parámetros farmacocinéticos para cada grupo de tratamiento en monoterapia que se calcularon según las fórmulas matemáticas del programa PK functions for Microsoft Excel; (5) fueron: - La concentración máxima del fármaco (Cmáx; mg/L) se definió como la mayor concentración alcanzada en cada uno de los experimentos.
- La semivida biológica (t1/2; h) se definió como el tiempo en que una determinada concentración de fármaco se redujo a la mitad de su valor.
- El área bajo la curva de concentración-tiempo desde cero a infinito (AUC; mg¿h/L) se definió como el área comprendida bajo los niveles plasmáticos del fármaco frente al tiempo.
La concentración de cada antimicrobiano, así como las pautas de administración de los mismos se ajustaron para los ensayos in vivo en función de los siguientes parámetros: Ciprofloxacino: El parámetro farmacodinámico predictor de eficacia es el AUC0-24h/CMI. Este debe alcanzar valores superiores a 100 para la cepa control E. coli ATCC/pBK. Además, se ajustó el esquema terapéutico para obtener valores de AUC0-24h similares a los alcanzados en humanos en un régimen de tratamiento de 250 mg orales o 200 mg iv cada 8 h.
Levofloxacino: Al igual que con ciprofloxacino se deben alcanzar valores superiores a 100 de AUC0-24h/CMI frente a la cepa control E. coli ATCC/pBK. También se ajustó para alcanzar valores similares de AUC0-24h a los alcanzados en humanos en tratamiento con 500 mg cada 24 h.
¿ Grupos de eficacia terapéutica en el modelo de neumonía experimental murina.
Para los experimentos in vivo se utilizaron las cepas recogidas en la tabla 1. Se utilizaron un total de 480 ratones entre 16 ¿ 18 g de peso que se distribuyeron en los siguientes grupos para cada cepa una de las cepas: - Control: los animales no reciben ningún tratamiento.
- Ciprofloxacino: los animales reciben 40 mg/Kg¿día ip.
- Levofloxacino dosis baja: los animales reciben 50 mg/Kg¿día ip.
- Levofloxacino dosis alta: los animales reciben 150 mg/Kg¿día ip.
Quince animales se adscribieron aleatoriamente a cada uno de los grupos de tratamiento en los experimentos para cada cepa, siendo éste un tamaño suficiente para detectar una diferencia de 1,5 Log10 UFC/g, con un error alfa de 0,05 y un error beta de 0,20.
Los tratamientos comenzaron una hora tras la inoculación. Todos los tratamientos se administraron ip. Las dosis de antimicrobianos se repartieron en dos dosis cada día durante una duración total de 72 h.
Variables analizadas en el estudio.
- Actividad bactericida de ambas fluoroquinolonas frente a las diferentes cepas del estudio.
- Cmáx, AUC, t1/2, AUC0-24h/CMI de ambas fluoroquinolonas administradas en monoterapia.
- Supervivencia de los grupos control y tras los diferentes grupos de tratamiento del estudio.
- Porcentaje de hemocultivos positivos de los grupos control y tras los distintos tratamientos.
- Log10 UFC/gramo de pulmón de los diferentes grupos de estudio.
Las variables cuantitativas referentes a los diferentes grupos (Log10 UFC/g de pulmón) se expresaron con la media aritmética como medida central y la desviación estándar como medida de dispersión. Las variables cualitativas (supervivencia, hemocultivos positivos) se expresaron en porcentajes.
El tamaño de los grupos de tratamiento se estableció para detectar una diferencia de 1,5 Log10 UFC/g con un error alfa de 0,05 y un error beta de 0,20.
Se comprobó la distribución normal de los datos relativos a los recuentos bacterianos mediante la prueba de Kolmogorov ¿ Smirnov. Los diferentes grupos terapéuticos (incluyendo todas las pautas y los controles) se compararon mediante el Análisis de la Varianza (ANOVA), con los tests de Tukey o Dunnett como pruebas post hoc. Por otro lado, se utilizó el test exacto de Fisher con doble cola en la comparación de variables dicotómicas no numéricas (bacteriemia, mortalidad). En todas las pruebas se consideró estadísticamente significativo un valor de p<0,05.
¿ RESULTADOS.
Estudios farmacocinéticos.
A partir de los resultados obtenidos en los estudios farmacocinéticos se procedió al cálculo de los parámetros Cmáx, t1/2 y AUC0-¿. Posteriormente, se calculó el parámetro farmacodinámico AUC0-¿/CMI, en función de cada una de las cepas del estudio. Los parámetros farmacocinéticos se detallan en la tabla 3. Los valores obtenidos el parámetro farmacodinámico predictor de eficacia AUC0-¿/CMI, se muestran en la tabla 4.
Tabla 3. Parámetros farmacocinéticos de ciprofloxacino y levofloxacino.
Antimicrobiano Dosis (mg/Kg) Cmáx (mg/L) AUC0-¿ (mg¿h/L) t1/2 (h) Ciprofloxacino 20 13,22 8,21 0,19 Levofloxacino 25 8,71 5,39 0,48 75 31,15 23,46 0,54 ¿ Tabla 4. Parámetros farmacodinámicos AUC0-¿/CMI de ciprofloxacino y levofloxacino.
Cepa Ciprofloxacino 20 mg/Kg Levofloxacino 25 mg/Kg 75 mg/Kg Grupo isogénico de E. coli ATCC 25922/pBK E. coli ATCC/pBK 4105,00 1347,61 5865 E. coli ATCC/qnrA 65,68 10,78 46,92 E. coli ATCC/qnrB 65,68 43,12 187,68 E. coli ATCC/qnrS 65,68 10,78 46,92 Grupo isogénico de E. coli ATCC 25922 -S83L/pBK E. coli ATCC-S83L/pBK 65,68 43,12 187,68 E. coli ATCC-S83L/qnrA 16,42 10,78 46,92 E. coli ATCC-S83L/qnrB 16,42 21,56 93,84 E. coli ATCC-S83L/qnrS 8,21 5,39 23,46 Elección de la dosis para los estudios de eficacia terapéutica.
Basándonos en los resultados obtenidos en los estudios de farmacocinética y farmacodinamia de ambos antimicrobianos, así como en los estudios previamente publicados sobre la eficacia optimizada de las quinolonas y los parámetros farmacocinéticos alcanzados en humanos tras los tratamientos estandarizados en la práctica clínica habitual, se eligieron los siguientes esquemas terapéuticos:
Ciprofloxacino: el esquema terapéutico elegido fue de 40 mg/Kg¿día repartidos en 2 dosis, es decir, una dosis cada 12 horas. Con este esquema se obtienen valores de AUC0-24h/CMI frente a la cepa control E. coli ATCC/pBK superiores a 100. Además los valores de AUC0-24h se asemejan a los alcanzados en humanos en tratamiento con 250 mg orales o 200 mg iv cada 8 horas.
Levofloxacino: en este caso fueron necesarios dos esquemas terapéuticos diferentes. En una primera aproximación se utilizaron 50 mg/Kg¿día repartidos en 2 dosis, para obtener valores de AUC0-24h/CMI frente a la cepa control E. coli ATCC/pBK superiores a 100. Por otro lado, se eligió un tratamiento de 150 mg/Kg¿día, también repartidos en dos dosis, para obtener valores de AUC0-24h que se asemejaran a los alcanzados en humanos en tratamiento con 500 mg orales cada 24 horas.
Eficacia terapéutica en el modelo de neumonía experimental murina.
Los resultados de los grupos de eficacia terapéutica se reflejan en las tablas 5 y 6.
¿ Tabla 5. Eficacia de ciprofloxacino (CPX) y levofloxacino (LVX) frente al grupo isogénico de E. coli ATCC 25922/pBK que expresan QnrA1, QnrB1 y QnrS, en el modelo de neumonía.
Cepa Grupo Dosis (mg/Kg¿día) Log10 UFC/g de pulmón (media ± DE) Mortalidad (%) Hemocultivos positivos (%) E. coli ATCC/pBK Control 9,37 ± 0,48 100 100 CPX 40 1,87 ± 2,07a 53,33a 0a LVX 50 1,67 ± 2,50a 28,57a 0a 150 1,52 ± 2,17a 50a 0a E. coli ATCC/qnrA Control 9,40 ± 0,25 100 92,86 CPX 40 5,71 ± 0,86a,b 53,33a 26,67a LVX 50 5,71 ± 0,75a,c 71,43a 21,40a 150 5,65 ± 0,79a,d 100d 20a E. coli ATCC/qnrB Control 8,84 ± 0,75 100 100 CPX 40 4,95 ± 1,71a,b 57,14a 35,71a,b LVX 50 4,54 ± 1,49a,c 50a 28,57a,c 150 3,50 ± 1,46a,d 35,71a 7,14a E. coli ATCC/qnrS Control 8,36 ± 1,26 93,33 93,33 CPX 40 5,38 ± 1,75a,b 42,86a 28,57a,b LVX 50 4,99 ± 1,63a,c 35,71a 21,43a 150 5,89 ± 1,25a,d 85,71d 28,57a,d Significación estadística (p<0,05): a: vs. grupo control interno; b: vs. E. coli ATCC/pBK tratado con ciprofloxacino; c: vs. E. coli ATCC/pBK tratado con levofloxacino (50 mg/Kg¿día); d: vs. E. coli ATCC/pBK tratado con levofloxacino (150 mg/Kg¿día).
¿ Tabla 6. Eficacia de ciprofloxacino (CPX) y levofloxacino (LVX) frente al grupo isogénico de E. coli ATCC 25922-S83L/pBK que expresan QnrA1, QnrB1 y QnrS, en el modelo de neumonía.
Cepa Grupo Dosis (mg/Kg¿día) Log10 UFC/g de pulmón (media ± DE) Mortalidad (%) Hemocultivos positivos (%) E. coli ATCC-S83L/pBK Control 9,55 ± 0,40 100 100 CPX 40 4,46 ± 2,10a 42,86a 28,57a LVX 50 3,61 ± 2,15a 57,14 a 42,86a 150 3,21 ± 2,44a 71,43a 7,14a E. coli ATCC-S83L/qnrA Control 9,38 ± 0,47 100 100 CPX 40 6,44 ± 1,20a,b 73,33a 60a LVX 50 6,45 ± 0,87a,c 86,67 60a 150 6,11 ± 0,63a,d 93,33 73,33a,d E. coli ATCC-S83L/qnrB Control 9,62 ± 0,31 100 100 CPX 40 5,82 ± 0,84a 60a 26,67a LVX 50 5,15 ± 1,29a 60a 20a 150 5,02 ± 1,39a 78,57 57,14a,d E. coli ATCC-S83L/qnrS Control 9,13 ± 0,63 100 93,75 CPX 40 6,29 ± 0,85a,b 87,5b 56,25a LVX 50 8,04 ± 0,99a,c 100c 93,34a,c 150 5,86 ± 0,76a,d,e 73,33a,e 40a,d,e Significación estadística (p<0,05): a: vs. grupo control interno; b: vs. E. coli ATCC-S83L/pBK tratado con ciprofloxacino; c: vs. E. coli ATCC-S83L/pBK tratado con levofloxacino (50 mg/Kg¿día); d: vs. E. coli ATCC-S83L/pBK tratado con levofloxacino (150 mg/Kg¿día); e: vs. E. coli ATCC-S83L/qnrS tratado con levofloxacino (50 mg/Kg¿día).
¿ CONCLUSIONES.
1. Ciprofloxacino, bajo un esquema terapéutico 40 mg/Kg¿día, fue eficaz en la reducción de la concentración bacteriana en el pulmón y del porcentaje de hemocultivos positivos frente a las cepas del estudio pertenecientes a ambos grupos isogénicos.
2. Levofloxacino, utilizando 50 y 150 mg/Kg¿día, fue eficaz en la reducción de la concentración bacteriana en el pulmón y del porcentaje de hemocultivos positivos frente a las cepas del estudio pertenecientes a ambos grupos isogénicos.
3. La presencia de los genes qnrA1, qnrB1 o qnrS1, en cepas de Escherichia coli, disminuyen la eficacia terapéutica de ciprofloxacino (40 mg/Kg¿día) y levofloxacino (50 y 150 mg/Kg¿día) en un modelo de neumonía experimental murina.
4. La presencia de los genes qnrA1 o qnrS1, en cepas de Escherichia coli con la mutación en GyrA Ser83Leu, disminuyen la eficacia terapéutica de ciprofloxacino (40 mg/Kg¿día) y levofloxacino (50 y 150 mg/Kg¿día) en un modelo de neumonía experimental murina.
5. La asociación de qnrB1 con la mutación en GyrA Ser83Leu no redujo la eficacia de los tratamientos con ciprofloxacino ni con levofloxacino.
¿ 6. El aumento en la dosis de levofloxacino de 50 a 150 mg/Kg¿día no produce una mayor reducción en la concentración bacteriana del pulmón, la mortalidad y los hemocultivos positivos, salvo frente a la cepa E. coli ATCC-S83L/qnrS con valor de CMI para levofloxacino de 1 mg/L, consideradas como sensibles según el CLSI, pero resistentes según el EUCAST.
7. La presencia de genes qnr en la infección experimental murina, diseminada y grave, por E. coli reducen le eficacia terapéutica de ciprofloxacino y levofloxacino, a pesar de mantener una CMI en los niveles que clasifican a dichas cepas como sensibles, según los criterios del CLSI y del EUCAST, con la salvedad de la cepa E. coli ATCC-S83L/qnrS que fue resistente a ciprofloxacino según los criterios del EUCAST.
8. Finalmente, los resultados de este trabajo sugieren que el valor superior a 100 del parámetro farmacodinámico AUC0-24h/MIC para asegurar el tratamiento efectivo con fluoroquinolonas en las infecciones por E. coli debe ser revisado, por cuanto se obtuvo eficacia terapéutica con valores de AUC0-24h/MIC inferiores a dicho valor.
