Análisis de genes implicados en la formación de patrones en el sistema vascular y en el fruto de arabidopsis thaliana
- Autores: Santiago González Reig
- Directores de la Tesis: Antonio Martínez Laborda (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Rosa Ponce Molet (presid.), Héctor Candela Anton (secret.), Miguel Angel Pérez Amador (voc.), Santiago Rafael Torres Martínez (voc.), Cristina Ferrandiz Maestre (voc.)
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
La presente tesis incluye el trabajo realizado durante mi estancia en el grupo de investigación del Área de Genética en el Campus de Sant Joan d¿Alacant, bajo la tutela del Dr. Antonio Martínez Laborda. Dicho trabajo aborda principalmente dos temas. Por un lado, están los experimentos encaminados a dilucidar la interacción entre la auxina y los genes HD-Zip de clase III en la formación de los haces vasculares en el tallo de Arabidopsis, publicados en el artículo Ochando et al., 2008, en el cual aparezco como coautor, compartiendo primera autoría con la Dra. Isabel Ochando; y por otro, los experimentos realizados para completar y concretar el modelo propuesto en la publicación de Alonso-Cantabrana et al., 2007, para explicar la formación de patrón en el eje medio-lateral del fruto, los cuales han sido incorporados al manuscrito como adjunto en la tesis, y que actualmente (Mayo 2012) está en fase de revisión en la revista PLoS Genetics y que probablemente acabe siendo publicado como González-Reig et al., 2012.
Alteración del patrón radial en el tallo de Arabidopsis mediante el uso de un alelo de ganancia de función del gen HD-Zip III INCURVATA4 Durante el escrutinio de mutantes morfológicos de la hoja pertenecientes a la colección del Arabidopsis Information Service (AIS), se describieron algunos mutantes que presentaban como característica principal la producción de hojas curvadas hacia el haz, un fenotipo que recibió el nombre de incurvata. Entre ellos, se obtuvieron dos que eran portadores de alelos semidominantes del gen INCURVATA4 (ICU4), los alelos icu4-1 e icu4-2 (Serrano-Cartagena et al., 1999; Serrano-Cartagena et al., 2000). Posteriormente, en un trabajo de colaboración entre mi laboratorio de acogida y los de los doctores José Luis Micol y María Rosa Ponce, se describieron los mutantes icu4-1 e icu4-2 y se clonó posicionalmente el gen afectado, determinándose que ambos alelos portaban la misma mutación consistente en un único cambio de base, una transición de G por A, en la quinta posición del exón 5 (Ochando et al., 2006). El gen ICU4, también conocido como CORONA (CNA) (Green et al., 2005; Prigge et al., 2005), codifica el factor de transcripción ATHB15, uno de los miembros de la familia de factores de transcripción HD-Zip de clase III. La transición que da lugar tanto a icu4-1 como a icu4-2 afecta a la región complementaria a los MIR165 y MIR166, dificultando el reconocimiento del mensajero del gen por los miRNA y la consiguiente degradación de éste. Ello da lugar a la desregulación del gen, siendo la razón por la que el alelo es de ganancia de función y semidominante.
El mutante icu4-1 sufre diferentes alteraciones, la mayoría de ellas causadas por fallos en la polaridad adaxial-abaxial. Debido a que los genes HD-Zip III codifican factores considerados formadores de identidad adaxial, el fenotipo más evidente es la presencia de hojas fuertemente adaxializadas, incurvadas hacia el haz, si bien también se observan algunas alteraciones en la raíz, de menor tamaño y con mayor número de raíces secundarias, debido a una leve desorganización en el RAM, así como modificaciones en el desarrollo vascular (Ochando et al., 2006).
Además, en el trabajo de Ochando y colaboradores (2006) también se describen los fenotipos que muestran algunas combinaciones mutantes, como los dobles mutantes icu4-1 hst-1 e icu4-1 hst-5. HASTY (HST) es una proteína importante en la maduración y estabilización de miRNAs, participando en el traslado de estas moléculas del núcleo al citoplasma (Park et al., 2005). En el doble mutante, se observan alteraciones sinérgicas, debido a una más que probable reducción en los niveles de miRNAs maduros, y a la consiguiente sobreexpresión de los genes regulados post-transcripcionalmente por éstos. Los fenotipos observados en los órganos laterales atienden a una severa adaxialización respecto a los mutantes simples, fácilmente observable tanto en las hojas como en los frutos, en los que se aprecia la presencia de óvulos ectópicos o fallos en el cierre apical. En este sentido, los dobles mutantes de icu4-1 con crc-1, afectado en CRABS CLAW (CRC), un gen de identidad abaxial de tipo YABBY, muestran alteraciones formalmente similares.
En un trabajo posterior, que se presenta como artículo en la presente tesis, se realiza un estudio más exhaustivo sobre las alteraciones que mostraba el mutante icu4-1 en su desarrollo vascular (Ochando et al., 2008, esta tesis). Este mutante tiene un menor número de haces vasculares en su eustela, si bien éstos son más anchos, modificando su estructura triangular normal y adoptando una forma trapezoidal. Además, esta alteración supone un incremento de las capas celulares en el procambium, así como un aumento del xilema y del floema. Las fibras interfasciculares también quedan modificadas, reduciendo su lignificación. Al tratarse de un mutante semidominante, de ganancia de función, estos resultados sugieren que la función normal del gen es la de activar la producción de tejido vascular.
En el trabajo se muestra, además, el fenotipo resultante de la combinación de icu4-1 con mutaciones de ganancia de función en otros genes HD-Zip III. En los mutantes resultantes de la introducción de un alelo de ganancia de función en el gen PHABULOSA (PHB) en el heterocigoto ICU4/icu4-1 (plantas ICU4/icu4-1;PHB/phb-1d), se produce un rescate del fenotipo en los órganos laterales, respecto al mostrado por el heterocigoto PHB/phb-1d, si bien se observa sinergia en el fenotipo mutante en los haces vasculares, lo que sugiere que ambos genes, PHB e ICU4, colaboran en la formación de los tejidos vasculares. Otra relación entre genes HD-Zip III analizada es la establecida entre ICU4 y REVOLUTA (REV), observándose que en el doble mutante icu4-1 rev se produce un rescate en el fenotipo anómalo de las fibras interfasciculares provocado por los alelos nulos rev. En definitiva, estos experimentos muestran un hecho que ya se había observado mediante la construcción de mutantes múltiples de pérdida de función en diferentes genes de la familia HD-Zip III, que es la existencia de relaciones complejas entre estos genes, siendo éstas tanto antagónicas como sinérgicas, dependiendo del órgano observado (Prigge et al., 2005), probablemente debido a la formación de homodímeros y heterodímeros de los productos con diferentes funcionalidades.
Finalmente, se estudia la implicación de las auxinas en la formación del tejido vascular y su relación con la función de los genes HD-Zip III en este proceso. La adición de auxina sintética NAA sobre las plantas silvestres produce un fenotipo muy similar al mostrado por los mutantes icu4-1 en los haces vasculares, mientras que dicho tratamiento modifica el fenotipo de las plantas mutantes, reduciendo aún más el número de haces y aumentando el tamaño de éstos. Teniendo en cuenta que ICU4, al igual que otros genes HD-Zip III, se activa por auxina (Zhou et al., 2007), estos resultados muestran una relación entre las auxinas y la formación del tejido vascular, que estaría mediada activamente por los productos codificados por los genes de la familia HD-Zip III.
Actividades génicas antagónicas determinan la formación de elementos de patrón a lo largo del eje medio-lateral del fruto de Arabidopsis Externamente, en el ovario de los frutos de Arabidopsis, se pueden distinguir tres territorios claramente definidos, que son elementos de patrón a lo largo del eje medio-lateral, las valvas, los repla y los márgenes de valva que delimitan los dos territorios anteriores. Entre cada una de estas zonas se establece una red compleja de interacciones génicas que regulan el moldeado de esta estructura. Cada uno de estos territorios muestra la expresión de genes característicos, que codifican factores de transcripción cuya función es la de reprimir genes activos en los territorios adyacentes, o bien, la de activar genes importantes para la diferenciación de su territorio de acción. En los trabajos previos (Dinneny et al., 2005; Alonso-Cantabrana et al., 2007), que constituyen la base del presente trabajo, se propuso un modelo para la formación de los tres elementos de patrón. En él, se establecía la existencia de dos funciones antagónicas, llevadas a cabo por los factores de valva y los factores de replum. Ambas actividades estarían formando gradientes, estableciéndose los máximos de éstos en la región central de cada territorio, la región más lateral del fruto en el caso de los factores de valva y la más medial para los factores de replum, mientras que los mínimos se darían en la zona donde surgirá el margen de valva, en la que ambos factores solaparían y tenderían a reprimirse entre sí (Alonso-Cantabrana et al., 2007). En el margen de valva, se activa la expresión de los genes SHATTERPROOF1 y 2 (SHP1 y SHP2), fundamentales para la determinación de dicha región, así como otros genes regulados positivamente por los dos anteriores, como INDEHISCENT (IND) o ALCATRAZ (ALC), los cuales tienen un papel fundamental en la lignificación y en la apertura del fruto en las fases finales del desarrollo (Liljegren et al., 2000; Rajani y Sundaresan, 2001; Liljegren et al., 2004). Un gen esencial para la formación de la valva es FRUITFULL (FUL), que codifica un factor de transcripción de la familia MADS-box cuya función es la de reprimir la expresión de los genes del margen de valva, evitando así la expresión ectópica de éstos en la valva (Gu et al., 1998; Ferrandiz et al., 2000b). Los factores de valva son los tres genes implicados en la actividad JAG/FIL, los genes YABBY FILAMENTOUS FLOWER (FIL) y YABBY3 (YAB3) y el gen JAGGED (JAG). Éstos se encargan tanto de la activación de FUL como la de los genes del margen de valva, de un modo que sería dependiente del nivel de actividad JAG/FIL. Así, elevados niveles de esta actividad, como los que se producirían en la valva, inducen la expresión de FUL, y bajos niveles, como los que se darían en el margen de valva, inducen las expresiones de los genes SHP1 y SHP2 (Dinneny et al., 2005).
Dentro de los factores de replum, encontramos a REPLUMLESS (RPL), un gen esencial para formar el replum, ya que los mutantes rpl carecen de esta estructura. Al igual que ocurría con FUL en la valva, su función está íntimamente relacionada con la represión de los genes del margen de valva, impidiendo así las expresiones ectópicas de éstos en el replum (Roeder et al., 2003). Aunque no se ha descartado experimentalmente que esta represión sea directa, ya que se ha demostrado que RPL reprime directamente a AG (Bao et al., 2004), un parálogo cercano a SHP1 y SHP2, sí se ha comprobado que tiene lugar de forma indirecta mediante la exclusión en el replum de la expresión de los genes de la actividad JAG/FIL (Dinneny et al., 2005). Otro gen clasificado como factor de replum es BREVIPEDICELLUS (BP), un gen KNOX de clase I, cuyo producto dimeriza con la proteína RPL, permitiendo la migración al núcleo y la regulación de las correspondientes dianas (Bellaoui et al., 2001; Müller et al., 2001; Smith et al., 2003). Además de la función conocida de reprimir la expresión de los genes de margen de valva en el replum, se ha propuesto que BP y RPL son genes de identidad de replum (Alonso-Cantabrana et al., 2007; Ripoll et al., 2011). Por otro lado, teniendo en cuenta que la ausencia de función de BP carece de fenotipo en el replum, se ha propuesto que SHOOT MERISTEMLESS (STM), un homólogo cercano a BP, también participa en la formación del replum, y dado que un exceso de BP da lugar al rescate del mutante rpl (Alonso-Cantabrana et al., 2007; Ripoll et al., 2011), parece probable que POUND-FOOLISH (PNF), un homólogo cercano a RPL, pueda sustituir a éste en determinadas situaciones. No obstante, no se puede rescatar la carencia simultánea de las funciones BP y RPL (Ripoll et al., 2011).
Otros genes se encargan de regular negativamente la expresión de BP. Este es el caso de los genes ASYMMETRIC LEAVES1 y 2 (AS1 y AS2), cuyos productos limitan los niveles de expresión de BP en el replum y evitan su expresión ectópica en la valva (Alonso-Cantabrana et al., 2007). En el mantenimiento de la expresión de BP en el replum por debajo de ciertos niveles coopera APETALA2, el cual, además de regular negativamente a BP, también reprime a los genes del margen de valva, limitando la extensión de este elemento de patrón (Ripoll et al., 2011).
Sin embargo, el modelo mencionado anteriormente para explicar la formación de patrón a lo largo del eje medio-lateral del fruto de Arabidopsis dejaba algunas hipótesis todavía por demostrar. La principal de ellas era el del antagonismo entre los factores de valva y los factores de replum, y la represión mutua entre ambos. Asimismo, quedaba por establecer si la relación entre los genes AS1 y AS2 y los factores de valva quedaba restringida únicamente a la exclusión de BP de las regiones laterales o si había alguna función adicional de dichos genes. Estas incógnitas quedan despejadas en el trabajo que se adjunta en la tesis.
En este trabajo, se redefinen los factores de valva y los factores de replum, a los que se les denomina factores laterales y factores medios o de replum, respectivamente. Esto se debe, por un lado, a que la actividad JAG/FIL, cuyos genes formaban lo que se había llamado factores de valva, actúa no solo en la formación de la valva, sino también en la formación del margen de valva, ambas regiones laterales. Por otro lado, parece poco probable que los genes expresados en el replum formen un gradiente que se expanda hasta las regiones del margen de valva, ya que nuestros propios resultados, así como publicaciones recientes (Ragni et al., 2008), muestran una expresión de los factores de replum delimitada única y exclusivamente a las regiones medias, de ahí la denominación de factores medios.
Un aspecto clave desarrollado en este trabajo es el estudio del antagonismo existente entre los factores laterales y los factores medios. Por un lado, tanto en los mutantes simples como en las combinaciones mutantes múltiples en los genes de la actividad JAG/FIL, se observa un claro aumento en la expresión de BP, que es mayor en el triple mutante fil yab3 jag, lo que implica además un incremento en el tamaño del replum, que muestra mayor número de células, así como una morfología anormal de éstas y la presencia anómala de estomas, de manera similar a lo que ocurre en los mutantes as1 y as2 o en los frutos 35S::BP. Dicho incremento se elimina con la pérdida de función del gen BP, lo que demuestra que el fenotipo se debe a la desregulación de este gen, e indica la existencia de una acción no autónoma de los factores laterales, expresados en lo que será la valva y el margen de valva, sobre el factor medio BP. Una acción no autónoma de características similares se ha descrito ya para FIL y YAB3, ya que estos genes se expresan en los órganos laterales y regulan la función del meristemo, mediante la regulación negativa de genes meristemáticos como WUSCHEL (WUS) y CLAVATA3 (CLV3) (Goldshmidt et al., 2008; Stahle et al., 2009). Por lo tanto, estos genes participan de forma no autónoma tanto en la correcta función del meristemo como en el desarrollo normal del replum. Por otro lado, la expresión de BP en la valva, tanto en el mutante as1 como en las plantas 35S::BP, produce una disminución de la expresión de todos los factores laterales, indicando que BP, a su vez, regula negativamente a los genes de la actividad JAG/FIL. La regulación negativa de BP sobre los genes de la actividad JAG/FIL es de tipo autónomo, impidiendo junto a RPL que estos genes laterales se expresen en la región que dará lugar al replum, ya que los mutantes nulos ap2, que presentan niveles más elevados de la expresión de BP en la región media, no tienen las valvas afectadas (Ripoll et al., 2011), de lo que se deduce que los niveles de la actividad JAG/FIL permanecen inalterados en estos fondos.
Por último, realizamos diversas combinaciones de mutaciones en los factores laterales con as1. La pérdida de AS1 unida a la eliminación parcial o completa de la función YABBY (FIL y YAB3) produce frutos en los que el replum es cada vez mayor en detrimento del territorio de valva, que cada vez es menor, llegando a desaparecer por completo cuando toda la función YABBY queda eliminada. Este resultado está de acuerdo con el hecho de que los factores laterales y los factores medios compitan en el eje medio-lateral, ocupando unos factores el espacio que los otros ceden. El que estos fenotipos nunca hayan sido observados en los mutantes múltiples en los genes de la actividad JAG/FIL, incluido el triple fil yab3 jag, parece indicar que son dependientes de la expresión ectópica de BP producida por la ausencia de función de AS1. De hecho, la sustitución de la mutación as1 por la construcción 35S::BP produce fenotipos similares, aunque más fuertes. Por tanto, AS1 quedaría definido como un elemento de cortafuegos, que colabora con los factores laterales limitando la expresión de BP únicamente a la región media que dará lugar al replum. Este hecho, unido a la interacción sinérgica que da as1 tanto con mutaciones fil y yab3 como con jag, que se tratará en el siguiente párrafo, nos ha llevado a incorporar la función de AS1 y de su gen colaborador AS2 (la función AS) como un componente más de los factores laterales.
El doble mutante as1 jag muestra una fuerte interacción sinérgica, observándose frutos con las valvas de un tamaño muy reducido y grandes repla. Si bien, la sinergia ya había sido demostrada recientemente en las flores de as1 jag, las cuales carecen de sépalos y de pétalos (Xu et al., 2008), en este trabajo se describe por primera vez en los frutos. No obstante, cuando se sobreexpresa el gen BP en un fondo mutante jag (plantas 35S::BP jag), el fenotipo obtenido es claramente más débil, lo que indica que, aun siendo BP causante de parte del fenotipo, la desregulación de éste no puede ser la única causa de la sinergia mostrada por el doble as1 jag, de manera que otros genes podrían estar también implicados. En este sentido, cabe destacar que los genes CUP-SHAPED COTYLEDON1 y 2 (CUC1 y CUC2), que se sobreexpresan en las flores de las plantas as1 jag (Xu et al., 2008), se expresan a niveles mucho más elevados en los pistilos del doble mutante as1 jag que en los de las plantas 35S::BP jag, de manera que ambos genes podrían estar implicados en el fenotipo sinérgico. De acuerdo con esto, el mutante de ganancia de función cuc2-d muestra un replum de mayor tamaño que el silvestre.
